Screening farmacologico cellulare per gli inibitori della peptidasi 4B cisteina correlata all'autofagia

Summary

Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per l'uso di un saggio reporter basato sulla luciferasi in un formato di screening semi-automatizzato ad alto rendimento.

Abstract

Prove crescenti hanno dimostrato che un elevato flusso autofagico è correlato alla progressione del tumore e alla resistenza alla terapia antitumorale. Il dosaggio delle singole proteine dell'autofagia è un prerequisito per le strategie terapeutiche mirate a questo percorso. È stato dimostrato che l'inibizione della proteasi autofagica ATG4B aumenta la sopravvivenza globale, suggerendo che ATG4B potrebbe essere un potenziale bersaglio farmacologico per la terapia del cancro. Il nostro laboratorio ha sviluppato un saggio selettivo basato sulla luciferasi per il monitoraggio dell'attività di ATG4B nelle cellule. Per questo saggio, il substrato di ATG4B, LC3B, è marcato all'estremità C con una luciferasi secretabile dal copepode marino Gaussia princeps (GLUC). Questo reporter è collegato al citoscheletro di actina, mantenendolo così nel citoplasma delle cellule quando non è disponibile. La scissione mediata da ATG4B provoca il rilascio di GLUC da parte di secrezioni non convenzionali, che possono quindi essere monitorate raccogliendo surnatanti da colture cellulari come correlato dell'attività cellulare di ATG4B. Questo articolo presenta l'adattamento di questo test basato sulla luciferasi allo screening automatizzato ad alto rendimento. Descriviamo il flusso di lavoro e l'ottimizzazione per un'analisi esemplare ad alto rendimento dell'attività cellulare ATG4B.

Introduction

L'autofagia è un processo metabolico conservato che consente alle cellule di mantenere l'omeostasi intracellulare e rispondere allo stress degradando il contenuto cellulare invecchiato, difettoso o non necessario attraverso i lisosomi ^1,2,3. In alcune condizioni fisiopatologiche, questo processo agisce come una risposta cellulare cruciale alla privazione di nutrienti e ossigeno, con conseguente riciclaggio di nutrienti e lipidi, consentendo alle cellule di adattarsi alle loro esigenze metaboliche

Protocol

NOTA: Il processo di analisi è descritto nella Figura 1. Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali, i reagenti e le attrezzature utilizzati in questo protocollo.

1. Produzione di retrovirus

NOTA: Il plasmide che codifica per ActinLC3dNGLUC è pMOWS-ActinLC3dNGLUC²⁰. Utilizzare un numero di cellule a basso passaggio per la produzione di virus ad al.......

Discussion

Questo protocollo descrive un saggio basato su cellule reporter-gene per l'identificazione degli inibitori di ATG4B. L'identificazione dei riscontri primari si basa sull'attività della luciferasi durante il trattamento di cellule che esprimono il frame di lettura aperto a lunghezza intera di LC3B tra β-actina e dNGLUC. Alcuni vantaggi di questo test sono che è sensibile, altamente quantitativo e non invasivo, in quanto può rilevare dNGLUC senza lisare le cellule. Questo articolo presenta un protocollo dettagliato per.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 µL Disposable Tips - Non-filtered, Pure, Nested 8 Stack (Passive Stack)	Tecan	30038609	Disposable 96-tip rack
BioTek MultiFlo	BioTek		bulk dispenser
Coelenterazine	Santa Cruz Biotechnology	sc-205904	substrate
Columbus Image analysis software	Perkin Elmer	Version 2.9.1	image analysis software
DPBS (1x)	Gibco	14190-144
Echo Qualified 384-Well Polypropylene Microplate, Clear, Non-sterile	Beckman Coulter	001-14555	384PP plate
EnVision II	Perkin Elmer		luminescence plate reader
Express pick Library (96-well)-L3600-Z369949-100µL	Selleckchem	L3600	Selleckchem
FMK9A	MedChemExpress	HY-100522
Greiner FLUOTRAC 200 384 well plates	Greiner Bio-One	781076	solid-black 384-well plates
Harmony Imaging software	Perkin Elmer	Version 5.1	imaging software
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in Water	ThermoFisher	H3570	Hoechst 33342
Labcyte Echo 550 series with Echo Cherry Pick software	Labcyte/Beckman Coulter		nanoscale acoustic liquid dispenser
Milli-Q water			deionized water
Opera Phenix High-Content Screening System	Perkin Elmer		automated microscope
Paraformaldehyde solution 4% in PBS	Santa Cruz Biotechnology	sc-281692
PhenoPlate 384-well, black, optically clear flat-bottom, tissue-culture treated, lids	Perkin Elmer	6057300	CellCarrier-384 Ultra PN
pMOWS-ActinLC3dNGLUC			Obtained from Dr. Robin Ketteler (Department of Human Medicine, Medical School Berlin)
Polybrene Infection / Transfection Reagent	Merck	TR-1003-G	polybrene
Puromycin dihydrochloride, 98%, Thermo Scientific Chemicals	ThermoFisher	J61278.ME	Puromycin
Tecan Freedom EVO 200 robot	Tecan		liquid handling robotic platform
X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent Roche	Merck	6366244001	DNA transfection reagent