Triagem de Drogas Baseadas em Células para Inibidores da Autofagia 4B Cisteína Peptidase Relacionada

Summary

Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para o uso de um ensaio de repórter baseado em luciferase em um formato de triagem semi-automatizado e de alto rendimento.

Abstract

Evidências crescentes têm mostrado que o alto fluxo autofágico está relacionado à progressão tumoral e à resistência à terapia do câncer. A dosagem de proteínas individuais de autofagia é um pré-requisito para estratégias terapêuticas direcionadas a essa via. Demonstrou-se que a inibição da protease autofágica ATG4B aumenta a sobrevida global, sugerindo que a ATG4B pode ser um potencial alvo de drogas para a terapia do câncer. Nosso laboratório desenvolveu um ensaio seletivo baseado em luciferase para monitorar a atividade de ATG4B em células. Para este ensaio, o substrato de ATG4B, LC3B, é marcado no término C com uma luciferase secretável do copépode marinho Gaussia princeps (GLUC). Este repórter está ligado ao citoesqueleto da actina, mantendo-o assim no citoplasma das células quando tido. A clivagem mediada por ATG4B resulta na liberação de GLUC por secreção não convencional, que pode ser monitorada pela coleta de sobrenadantes de cultura celular como um correlato da atividade celular de ATG4B. Este artigo apresenta a adaptação deste ensaio baseado em luciferase para triagem automatizada de alto rendimento. Descrevemos o fluxo de trabalho e a otimização para uma análise exemplar de alto rendimento da atividade ATG4B celular.

Introduction

A autofagia é um processo metabólico conservado que permite às células manter a homeostase intracelular e responder ao estresse degradando conteúdos celulares envelhecidos, defeituosos ou desnecessários através dos lisossomos ^1,2,3. Em algumas condições fisiopatológicas, esse processo atua como uma resposta celular crucial à privação de nutrientes e oxigênio, resultando em nutrientes e lipídios reciclados, permitindo que as células se adaptem às suas necessidades metabólicas ^2,3,4

Protocol

NOTA: O processo de ensaio é descrito na Figura 1. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais, reagentes e equipamentos usados neste protocolo.

1. Produção de retrovírus

NOTA: O plasmídeo que codifica o ActinLC3dNGLUC é pMOWS-ActinLC3dNGLUC²⁰. Use um número baixo de células para a produção de vírus de alto título (idealmente men.......

Discussion

Este protocolo descreve um ensaio genético-repórter baseado em células para a identificação de inibidores de ATG4B. A identificação de hits primários é baseada na atividade da luciferase no tratamento de células que expressam o quadro de leitura aberto de comprimento total da LC3B entre β-actina e dNGLUC. Algumas vantagens deste ensaio são que ele é sensível, altamente quantitativo e não invasivo, pois pode detectar dNGLUC sem lisar as células. Este trabalho apresenta um protocolo detalhado para geração.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 µL Disposable Tips - Non-filtered, Pure, Nested 8 Stack (Passive Stack)	Tecan	30038609	Disposable 96-tip rack
BioTek MultiFlo	BioTek		bulk dispenser
Coelenterazine	Santa Cruz Biotechnology	sc-205904	substrate
Columbus Image analysis software	Perkin Elmer	Version 2.9.1	image analysis software
DPBS (1x)	Gibco	14190-144
Echo Qualified 384-Well Polypropylene Microplate, Clear, Non-sterile	Beckman Coulter	001-14555	384PP plate
EnVision II	Perkin Elmer		luminescence plate reader
Express pick Library (96-well)-L3600-Z369949-100µL	Selleckchem	L3600	Selleckchem
FMK9A	MedChemExpress	HY-100522
Greiner FLUOTRAC 200 384 well plates	Greiner Bio-One	781076	solid-black 384-well plates
Harmony Imaging software	Perkin Elmer	Version 5.1	imaging software
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in Water	ThermoFisher	H3570	Hoechst 33342
Labcyte Echo 550 series with Echo Cherry Pick software	Labcyte/Beckman Coulter		nanoscale acoustic liquid dispenser
Milli-Q water			deionized water
Opera Phenix High-Content Screening System	Perkin Elmer		automated microscope
Paraformaldehyde solution 4% in PBS	Santa Cruz Biotechnology	sc-281692
PhenoPlate 384-well, black, optically clear flat-bottom, tissue-culture treated, lids	Perkin Elmer	6057300	CellCarrier-384 Ultra PN
pMOWS-ActinLC3dNGLUC			Obtained from Dr. Robin Ketteler (Department of Human Medicine, Medical School Berlin)
Polybrene Infection / Transfection Reagent	Merck	TR-1003-G	polybrene
Puromycin dihydrochloride, 98%, Thermo Scientific Chemicals	ThermoFisher	J61278.ME	Puromycin
Tecan Freedom EVO 200 robot	Tecan		liquid handling robotic platform
X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent Roche	Merck	6366244001	DNA transfection reagent