Triagem de Drogas Baseadas em Células para Inibidores da Autofagia 4B Cisteína Peptidase Relacionada

Evidências crescentes têm mostrado que o alto fluxo autofágico está relacionado à progressão tumoral e à resistência à terapia do câncer. A dosagem de proteínas individuais de autofagia é um pré-requisito para estratégias terapêuticas direcionadas a essa via. Demonstrou-se que a inibição da protease autofágica ATG4B aumenta a sobrevida global, sugerindo que a ATG4B pode ser um potencial alvo de drogas para a terapia do câncer. Nosso laboratório desenvolveu um ensaio seletivo baseado em luciferase para monitorar a atividade de ATG4B em células. Para este ensaio, o substrato de ATG4B, LC3B, é marcado no término C com uma luciferase secretável do copépode marinho Gaussia princeps (GLUC). Este repórter está ligado ao citoesqueleto da actina, mantendo-o assim no citoplasma das células quando tido. A clivagem mediada por ATG4B resulta na liberação de GLUC por secreção não convencional, que pode ser monitorada pela coleta de sobrenadantes de cultura celular como um correlato da atividade celular de ATG4B. Este artigo apresenta a adaptação deste ensaio baseado em luciferase para triagem automatizada de alto rendimento. Descrevemos o fluxo de trabalho e a otimização para uma análise exemplar de alto rendimento da atividade ATG4B celular.