Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Здесь мы опишем подробный протокол использования репортерного анализа на основе люциферазы в полуавтоматическом формате скрининга с высокой пропускной способностью.

Abstract

Появляется все больше доказательств того, что высокий аутофагический поток связан с прогрессированием опухоли и резистентностью к терапии рака. Анализ отдельных белков аутофагии является необходимым условием для терапевтических стратегий, нацеленных на этот путь. Было показано, что ингибирование протеазы аутофагии ATG4B увеличивает общую выживаемость, что позволяет предположить, что ATG4B может быть потенциальной мишенью для терапии рака. Наша лаборатория разработала селективный анализ на основе люциферазы для мониторинга активности ATG4B в клетках. Для этого анализа субстрат ATG4B, LC3B, помечается на С-конце секретируемой люциферазой морского веслоногого рачка Gaussia princeps (GLUC). Этот репортер связан с актиновым цитоскелетом, таким образом, удерживая его в цитоплазме клеток при расщеплении. ATG4B-опосредованное расщепление приводит к высвобождению GLUC путем нетрадиционной секреции, которую затем можно контролировать путем забора надосадочной жидкости из клеточной культуры в качестве коррелята клеточной активности ATG4B. В данной статье представлена адаптация этого анализа на основе люциферазы к автоматизированному высокопроизводительному скринингу. Описан рабочий процесс и оптимизация для примерного высокопроизводительного анализа клеточной активности ATG4B.

Introduction

Аутофагия — это консервативный метаболический процесс, который позволяет клеткам поддерживать внутриклеточный гомеостаз и реагировать на стресс путем разложения старого, дефектного или ненужного клеточного содержимого через лизосомы 1,2,3. При некоторых патофизиологических условиях этот процесс действует как важнейшая клеточная реакция на недостаток питательных веществ и кислорода, что приводит к рециркуляции питательных веществ и липидов, позволяя клеткам адаптироваться к своим метаболическим потребностям

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс анализа показан на рисунке 1. Смотрите Таблицу материалов для получения подробной информации, связанной со всеми материалами, реагентами и оборудованием, используемыми в этом протоколе.

1. Производство ретровирусов

.......

Representative Results

В предыдущей публикации8 мы успешно использовали этот анализ для скрининга библиотек малых молекул и миРНК и идентифицировали новые регуляторы ATG4B. Здесь мы опишем протокол и репрезентативные результаты этого репортера люциферазы в полуавтоматическом формате скрининга ?.......

Discussion

Этот протокол описывает клеточный анализ репортерных генов для идентификации ингибиторов ATG4B. Идентификация первичных попаданий основана на активности люциферазы при обработке клеток, экспрессирующих полноразмерную открытую рамку считывания LC3B между β-актином и dNGLUC. Некоторые преи?.......

Acknowledgements

Эта работа была поддержана основным финансированием Совета по медицинским исследованиям Великобритании в рамках гранта MRC-UCL University Unit Grant Ref MC_U12266B, гранта MRC Dementia Platform Grant UK MR/M02492X/1, Pancreatic Cancer UK (ссылка на грант 2018RIF_15) и схемы поддержки терапевтического ускорения UCL при финансовой поддержке MRC Confidence in Concept 2020 UCL MC/PC/19054. Плазмида, кодирующая ActinLC3dNGLUC (pMOWS-ActinLC3dNGLUC), была получена у доктора Робина Кеттелера (Robin Ketteler) (Факультет медицины человека, Берлинская медицинская школа).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
50 µL Disposable Tips - Non-filtered, Pure, Nested 8 Stack (Passive Stack)Tecan30038609Disposable 96-tip rack
BioTek MultiFloBioTekbulk dispenser
CoelenterazineSanta Cruz Biotechnologysc-205904substrate
Columbus Image analysis softwarePerkin ElmerVersion 2.9.1image analysis software
DPBS (1x)Gibco14190-144
Echo Qualified 384-Well Polypropylene Microplate, Clear, Non-sterileBeckman Coulter001-14555384PP plate
EnVision IIPerkin Elmerluminescence plate reader
Express pick Library (96-well)-L3600-Z369949-100µLSelleckchemL3600Selleckchem
FMK9AMedChemExpressHY-100522
Greiner FLUOTRAC 200 384 well platesGreiner Bio-One781076solid-black 384-well plates
Harmony Imaging softwarePerkin ElmerVersion 5.1imaging software
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in WaterThermoFisherH3570Hoechst 33342
Labcyte Echo 550 series with Echo Cherry Pick softwareLabcyte/Beckman Coulternanoscale acoustic liquid dispenser
Milli-Q waterdeionized water
Opera Phenix High-Content Screening SystemPerkin Elmerautomated microscope
Paraformaldehyde solution 4% in PBSSanta Cruz Biotechnologysc-281692
PhenoPlate 384-well, black, optically clear flat-bottom, tissue-culture treated, lidsPerkin Elmer6057300CellCarrier-384 Ultra PN
pMOWS-ActinLC3dNGLUCObtained from Dr. Robin Ketteler (Department of Human Medicine, Medical School Berlin)
Polybrene Infection / Transfection ReagentMerckTR-1003-Gpolybrene
Puromycin dihydrochloride, 98%, Thermo Scientific ChemicalsThermoFisherJ61278.MEPuromycin
Tecan Freedom EVO 200 robotTecanliquid handling robotic platform
X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent RocheMerck6366244001DNA transfection reagent

References

  1. Kocaturk, N. M., et al. Autophagy as a molecular target for cancer treatment. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 134, 116-137 (2019).
  2. Fu, Y., et al. Targeting ATG4 in cancer therapy. Cancers. 11 (5), 649 (2019)....

Explore More Articles

196

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved