A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Здесь мы опишем подробный протокол использования репортерного анализа на основе люциферазы в полуавтоматическом формате скрининга с высокой пропускной способностью.
Появляется все больше доказательств того, что высокий аутофагический поток связан с прогрессированием опухоли и резистентностью к терапии рака. Анализ отдельных белков аутофагии является необходимым условием для терапевтических стратегий, нацеленных на этот путь. Было показано, что ингибирование протеазы аутофагии ATG4B увеличивает общую выживаемость, что позволяет предположить, что ATG4B может быть потенциальной мишенью для терапии рака. Наша лаборатория разработала селективный анализ на основе люциферазы для мониторинга активности ATG4B в клетках. Для этого анализа субстрат ATG4B, LC3B, помечается на С-конце секретируемой люциферазой морского веслоногого рачка Gaussia princeps (GLUC). Этот репортер связан с актиновым цитоскелетом, таким образом, удерживая его в цитоплазме клеток при расщеплении. ATG4B-опосредованное расщепление приводит к высвобождению GLUC путем нетрадиционной секреции, которую затем можно контролировать путем забора надосадочной жидкости из клеточной культуры в качестве коррелята клеточной активности ATG4B. В данной статье представлена адаптация этого анализа на основе люциферазы к автоматизированному высокопроизводительному скринингу. Описан рабочий процесс и оптимизация для примерного высокопроизводительного анализа клеточной активности ATG4B.
Аутофагия — это консервативный метаболический процесс, который позволяет клеткам поддерживать внутриклеточный гомеостаз и реагировать на стресс путем разложения старого, дефектного или ненужного клеточного содержимого через лизосомы 1,2,3. При некоторых патофизиологических условиях этот процесс действует как важнейшая клеточная реакция на недостаток питательных веществ и кислорода, что приводит к рециркуляции питательных веществ и липидов, позволяя клеткам адаптироваться к своим метаболическим потребностям
ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс анализа показан на рисунке 1. Смотрите Таблицу материалов для получения подробной информации, связанной со всеми материалами, реагентами и оборудованием, используемыми в этом протоколе.
1. Производство ретровирусов
.......В предыдущей публикации8 мы успешно использовали этот анализ для скрининга библиотек малых молекул и миРНК и идентифицировали новые регуляторы ATG4B. Здесь мы опишем протокол и репрезентативные результаты этого репортера люциферазы в полуавтоматическом формате скрининга ?.......
Этот протокол описывает клеточный анализ репортерных генов для идентификации ингибиторов ATG4B. Идентификация первичных попаданий основана на активности люциферазы при обработке клеток, экспрессирующих полноразмерную открытую рамку считывания LC3B между β-актином и dNGLUC. Некоторые преи?.......
Эта работа была поддержана основным финансированием Совета по медицинским исследованиям Великобритании в рамках гранта MRC-UCL University Unit Grant Ref MC_U12266B, гранта MRC Dementia Platform Grant UK MR/M02492X/1, Pancreatic Cancer UK (ссылка на грант 2018RIF_15) и схемы поддержки терапевтического ускорения UCL при финансовой поддержке MRC Confidence in Concept 2020 UCL MC/PC/19054. Плазмида, кодирующая ActinLC3dNGLUC (pMOWS-ActinLC3dNGLUC), была получена у доктора Робина Кеттелера (Robin Ketteler) (Факультет медицины человека, Берлинская медицинская школа).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
50 µL Disposable Tips - Non-filtered, Pure, Nested 8 Stack (Passive Stack) | Tecan | 30038609 | Disposable 96-tip rack |
BioTek MultiFlo | BioTek | bulk dispenser | |
Coelenterazine | Santa Cruz Biotechnology | sc-205904 | substrate |
Columbus Image analysis software | Perkin Elmer | Version 2.9.1 | image analysis software |
DPBS (1x) | Gibco | 14190-144 | |
Echo Qualified 384-Well Polypropylene Microplate, Clear, Non-sterile | Beckman Coulter | 001-14555 | 384PP plate |
EnVision II | Perkin Elmer | luminescence plate reader | |
Express pick Library (96-well)-L3600-Z369949-100µL | Selleckchem | L3600 | Selleckchem |
FMK9A | MedChemExpress | HY-100522 | |
Greiner FLUOTRAC 200 384 well plates | Greiner Bio-One | 781076 | solid-black 384-well plates |
Harmony Imaging software | Perkin Elmer | Version 5.1 | imaging software |
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher | H3570 | Hoechst 33342 |
Labcyte Echo 550 series with Echo Cherry Pick software | Labcyte/Beckman Coulter | nanoscale acoustic liquid dispenser | |
Milli-Q water | deionized water | ||
Opera Phenix High-Content Screening System | Perkin Elmer | automated microscope | |
Paraformaldehyde solution 4% in PBS | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | |
PhenoPlate 384-well, black, optically clear flat-bottom, tissue-culture treated, lids | Perkin Elmer | 6057300 | CellCarrier-384 Ultra PN |
pMOWS-ActinLC3dNGLUC | Obtained from Dr. Robin Ketteler (Department of Human Medicine, Medical School Berlin) | ||
Polybrene Infection / Transfection Reagent | Merck | TR-1003-G | polybrene |
Puromycin dihydrochloride, 98%, Thermo Scientific Chemicals | ThermoFisher | J61278.ME | Puromycin |
Tecan Freedom EVO 200 robot | Tecan | liquid handling robotic platform | |
X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent Roche | Merck | 6366244001 | DNA transfection reagent |
Explore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved