Cellbaserad läkemedelsscreening för hämmare av autofagirelaterat 4B-cysteinpeptidas

Växande bevis har visat att högt autofagiskt flöde är relaterat till tumörprogression och cancerterapiresistens. Analys av enskilda autofagiproteiner är en förutsättning för terapeutiska strategier som riktar sig mot denna signalväg. Hämning av autofagiproteaset ATG4B har visat sig öka den totala överlevnaden, vilket tyder på att ATG4B kan vara ett potentiellt läkemedelsmål för cancerbehandling. Vårt laboratorium har utvecklat en selektiv luciferasbaserad analys för övervakning av ATG4B-aktivitet i celler. För denna analys märks substratet för ATG4B, LC3B, vid C-terminalen med ett utsöndringsbart luciferas från den marina hoppkräftan Gaussia princeps (GLUC). Denna rapportör är kopplad till aktincytoskelettet och håller den på så sätt i cellernas cytoplasma när den är olöst. ATG4B-medierad klyvning resulterar i frisättning av GLUC genom icke-konventionell sekretion, som sedan kan övervakas genom att skörda supernatanter från cellodling som ett korrelat av cellulär ATG4B-aktivitet. Denna artikel presenterar anpassningen av denna luciferasbaserade analys till automatiserad screening med hög genomströmning. Vi beskriver arbetsflödet och optimeringen för exemplifierande analys av cellulär ATG4B-aktivitet med hög genomströmning.