Abgleich von synchronisierten Zeitreihendaten unter Verwendung des Modells zur Charakterisierung des Zellzyklusverlusts für experimentübergreifende Vergleiche

Zusammenfassung

Eine Herausforderung bei der Analyse synchronisierter Zeitreihenexperimente besteht darin, dass sich die Experimente oft in der Dauer der Erholung von der Synchronität und der Zellzyklusperiode unterscheiden. Daher können die Messungen aus verschiedenen Experimenten nicht aggregiert analysiert oder ohne weiteres verglichen werden. Hier beschreiben wir eine Methode zur Ausrichtung von Experimenten, um phasenspezifische Vergleiche zu ermöglichen.

Zusammenfassung

Die Untersuchung des Zellzyklus hängt oft von der Synchronisierung von Zellpopulationen ab, um verschiedene Parameter in einer Zeitreihe zu messen, während die Zellen den Zellzyklus durchlaufen. Aber auch unter ähnlichen Bedingungen zeigen Replikationsexperimente Unterschiede in der Zeit, die benötigt wird, um sich von der Synchronität zu erholen und den Zellzyklus zu durchlaufen, wodurch direkte Vergleiche zu jedem Zeitpunkt verhindert werden. Das Problem des Vergleichs dynamischer Messungen in verschiedenen Experimenten wird in mutierten Populationen oder unter alternativen Wachstumsbedingungen, die sich auf die synchrone Erholungszeit und/oder die Zellzykluszeit auswirken, noch verschärft.

Wir haben bereits ein parametrisches mathematisches Modell mit dem Namen Characterizing Loss of Cell Cycle Synchrony (CLOCCS) veröffentlicht, das überwacht, wie sich synchrone Zellpopulationen aus der Synchronität lösen und den Zellzyklus durchlaufen. Die gelernten Parameter aus dem Modell können dann verwendet werden, um experimentelle Zeitpunkte aus synchronisierten Zeitreihenexperimenten in eine normalisierte Zeitskala (Lebenslinienpunkte) umzuwandeln. Anstatt die verstrichene Zeit in Minuten seit Beginn des Experiments darzustellen, stellt die Lebenslinienskala den Verlauf von der Synchronität zum Eintritt in den Zellzyklus und dann durch die Phasen des Zellzyklus dar. Da die Lebenslinienpunkte der Phase der durchschnittlichen Zelle innerhalb der synchronisierten Population entsprechen, ermöglicht diese normalisierte Zeitskala direkte Vergleiche zwischen Experimenten, einschließlich solcher mit unterschiedlichen Zeiträumen und Erholungszeiten. Darüber hinaus wurde das Modell verwendet, um Zellzyklusexperimente zwischen verschiedenen Arten (z.B. Saccharomyces cerevisiae und Schizosaccharomyces pombe) aufeinander abzustimmen, wodurch ein direkter Vergleich von Zellzyklusmessungen ermöglicht wird, die evolutionäre Ähnlichkeiten und Unterschiede aufzeigen können.

Einleitung

Zeitreihenmessungen an synchronisierten Zellpopulationen auf ihrem Weg durch den Zellzyklus sind eine Standardmethode zur Untersuchung der Mechanismen, die das Fortschreiten des Zellzyklus steuern 1,2,3,4,5,6,7,8 . Die Fähigkeit, Vergleiche zwischen Synchronie-/Release-Zeitreihenexperimenten anzustellen, ist für unser Verständnis dieser dynamischen Prozesse von entscheidender Bedeutung. Die Verwendung von Wiederholungsexperimenten zur Bestätigung der Ergebnisse kann das Vertrauen in die Reproduzierbarkeit der Schlussfolgerungen erhöhen. Darüber hinaus können Vergleiche zwischen Umweltbedingungen, Mutanten und sogar zwischen Spezies viele neue Erkenntnisse über die Regulation des Zellzyklus liefern. Die interexperimentelle Variabilität in der Erholung von der Synchronität und in der Geschwindigkeit des Zellzyklusfortschritts beeinträchtigt jedoch die Fähigkeit, Zeitpunkt-zu-Zeitpunkt-Vergleiche zwischen Replikaten oder zwischen Experimenten mit verändertem Zellzyklus-Timing anzustellen. Aufgrund dieser Herausforderungen werden Replikate oft nicht für die gesamte Zeitreihe einbezogen (z. B. Spellman et ^al.4). Wenn Replikationen für die gesamte Zeitreihe gesammelt werden, können die Daten nicht aggregiert analysiert werden, sondern es wird ein einzelnes Replikat für die Analyse verwendet, und andere Replikate werden oft auf zusätzliche Zahlen verwiesen (z. B. Orlando et ^al.8). Darüber hinaus sind Vergleiche zwischen Experimenten mit unterschiedlichen Erholungs- oder Zellzyklus-Progressionsmerkmalen schwierig. Die Messung kleinerer Intervalle zwischen einem Ereignis von Interesse und einem Meilenstein des Zellzyklus (z. B. Knospenaufgang, Eintritt in die S-Phase oder Beginn der Anaphase) kann dazu beitragen, Fehler zu reduzieren, wenn diese Orientierungsereignisse verfolgt werden 1,2,3,9,10,11,12. Subtile, aber wichtige Unterschiede können jedoch bei diesen Ad-hoc-Methoden unentdeckt oder verschleiert bleiben. Schließlich ermöglichen Einzelzellanalysen die Analyse des Zellzyklusverlaufs, ohne auf Synchronisation oder Ausrichtung angewiesen zu sein¹³, obwohl groß angelegte Messungen in Einzelzellstudien schwierig und kostspielig sein können.

Um diese Schwierigkeiten zu überwinden, haben wir das Modell Characterizing Loss of Cell Cycle Synchrony (CLOCCS) entwickelt, um die Analyse von Zeitreihenmessungen an synchronisierten Populationen zu unterstützen^14,15. CLOCCS ist ein flexibles mathematisches Modell, das die Verteilung synchronisierter Zellen über die Phasen des Zellzyklus hinweg beschreibt, wenn sie aus der Synchronität befreit werden und den Zellzyklus durchlaufen. Der Rahmen für den Verzweigungsprozess ermöglicht es dem Modell, die asymmetrischen Eigenschaften von Mutter- und Tochterzellen nach der Teilung zu berücksichtigen, wie sie bei S. cerevisiae beobachtet wurden, während es für Organismen, die sich durch Spaltung teilen, wie z. B. S. pombe, immer noch nützlich ist. Das Modell kann Eingaben aus einer Vielzahl von Messtypen verwenden, um die Zellzyklusphase zu spezifizieren. Es kann Phasendaten des knospenden Zellzyklus aufnehmen, die Messungen des Prozentsatzes der knospenden Zellen im Laufe der Zeit enthalten, was die Schätzung der Anzahl der Zellen außerhalb der nicht knospenden G1-Phase ermöglicht^14,15. Das Modell kann auch durchflusszytometrische Daten aufnehmen, die den DNA-Gehalt messen, und ermöglicht so die Beurteilung von Landmark-Übergängen von G1 zu S, S zu G2 und M zu G1¹⁵. Fluoreszierende morphologische Marker können auch verwendet werden, um die Phase des Zellzyklus zu identifizieren. Die Fluoreszenzmarkierung von Myosinringen, Zellkernen und Spindelpolkörpern (SPBs) kann zur Bestimmung der Zellzyklusphase verwendet werden, und diese wurden in das CLOCCS-Modell¹¹ integriert. Diese Messungen werden in diesem Protokoll jedoch nicht beschrieben. Zusätzlich wurde der Septationsindex als Input für die Modellierung von Daten von S. pombe¹⁴ verwendet. Somit kann das Modell für Zellzyklusanalysen in einer Vielzahl von Organismen eingesetzt und weiter ausgebaut werden.

CLOCCS ist ein parametrisches Modell, das die vollständige Bayes'sche Inferenz mehrerer Parameter aus den Eingabedaten (z. B. Knospungsprozentsatz, DNA-Gehalt) ermöglicht. Zu diesen Parametern gehören die Erholungszeit von der Synchronität, die Länge der Zellzyklusperiode (getrennt geschätzt für Mutter- und Tochterzellen) und die durchschnittliche Zellzyklusposition der Zellen zu jedem Zeitpunkt. Diese Parameter repräsentieren das Verhalten der durchschnittlichen Zelle in der Population und ermöglichen es dem Forscher, jeden Zeitpunkt einer Zellzyklusposition zuzuordnen, die als Lebenslinienpunkt ausgedrückt wird. Die Umrechnung in Seilsicherungspunkte hängt von den CLOCCS-Parametern lambda (λ) und mu0 (μ₀)^14,15 ab. Der Parameter λ entspricht der durchschnittlichen Zellzykluszeit der Mutterzellen. Aufgrund der Mutter-Tochter-Verzögerung^14,15 ist dies jedoch nicht die durchschnittliche Zellzyklusperiode der gesamten Population, die sowohl die Mutter- als auch die Tochterzellen umfasst. CLOCCS leitet zusätzlich den Parameter delta (δ ab, der der Mutter-Tochter-Verzögerung entspricht und somit die Berechnung der durchschnittlichen Zellzyklusperiode der gesamten Population ermöglicht. Da jedes Experiment nach der Freigabe der Zellzyklussynchronisierung beginnt, wird die Zeit, die für die Wiederherstellung nach der Synchronisationsmethode erforderlich ist, durch den CLOCCS-Parameter μ₀ dargestellt. CLOCCS passt ein Modell an die eingegebenen Zellzyklus-Phasendaten an und leitet diese Parameter dann mit einem Random-Walk-Markov-Ketten-Monte-Carlo-Algorithmus^{ab 14,15}. Durch die Zuordnung mehrerer Experimente zu einer gemeinsamen Zeitskala der Zellzykluslebenslinie können direkte phasenspezifische Vergleiche zwischen Replikaten oder Experimenten durchgeführt werden, bei denen die Erholungszeit oder die Zellzykluszeiten nicht identisch sind 8,14,15.

Da synchronisierte Populationen im Laufe der Zeitreihen^14,15,16,17 mit einer gewissen Rate an Synchronität verlieren^, kann die Variabilität der Rate des Synchronitätsverlusts auch quantitative Vergleiche zwischen Experimenten erschweren. Durch die Identifizierung der Position von Populationen und der Varianz in ihren Verteilungen berücksichtigt CLOCCS Unterschiede in den Raten des Synchronitätsverlusts. Dieses leistungsstarke Werkzeug ermöglicht spezifische und detaillierte Vergleiche zwischen Experimenten und bietet so die Möglichkeit, relevante Vergleiche nicht nur zwischen Replikaten, sondern auch zwischen Umweltbedingungen, Mutanten und sogar Spezies mit dramatisch unterschiedlichem Zellzyklus-Timing direkt durchzuführen^14,15.

In diesem Artikel wird eine Methode beschrieben, die CLOCCS verwendet, um Parameter zu schätzen, indem Daten aus Synchronie-/Release-Zeitreihenexperimenten angepasst, die Daten einer gemeinsamen Lebenslinienskala zugeordnet und dann relevante Vergleiche zwischen Wiederholungen oder Experimenten durchgeführt werden. Die Ausrichtung der Lebenslinie ermöglicht direkte phasenspezifische Vergleiche zwischen diesen Experimenten, was die Aggregation und den Vergleich von Replikaten sowie relevantere Vergleiche zwischen Experimenten mit unterschiedlichen Erholungszeiten und Zellzyklusperioden ermöglicht.

Protokoll

1. Sammeln von Zellzyklusphasen- und experimentellen Daten

1. Synchronisieren Sie die Zellen in Bezug auf den Zellzyklus unter Verwendung der gewünschten Synchronisationsmethode (z. B. zentrifugale Abschlämmung, wie in Leman et al.18 beschrieben, oder Paarungspheromonarrest, wie in Rosebrock 19 beschrieben; sowohl Leman et al.18 als auch Rosebrock ¹⁹ beinhalten auch Methoden zur Freisetzung aus der Synchronität). Beginnen Sie mit der Stichprobenentnahme während der gesamten Zeitreihe, stellen Sie sicher, dass die Zeitreihe mindestens zwei volle Zellzyklusperioden lang ist, und sammeln Sie optimalerweise mindestens 10 Stichproben pro Zellzyklus. Sammeln Sie zu jedem Zeitpunkt eine Probe für Zellzyklusphasendaten (Knospung oder Durchflusszytometrie) und eine Probe für experimentelle Daten, wie unten beschrieben.
2. Wenn Sie Knospungsdaten als Zellzyklusphasendaten verwenden, sammeln Sie Daten zum Knospung für das CLOCCS-Alignment.
   1. Stichprobe während der gesamten Zeitreihe. Sammeln Sie für jeden Zeitpunkt Zellen und fixieren Sie sie, indem Sie 200 μl beschallte Zellkultur mit 200 μl Fixierlösung mischen, wie in Leman et ^al.18 beschrieben.
   2. Für die Standard-Knospung zählen Sie mindestens 200 Zellen pro Zeitpunkt mit einem Durchlichtmikroskop mit einem 40x-Objektiv und einem Hämozytometer. Geben Sie die Zellprobe aus Schritt 1.2.1 in das Hämozytometer und verdünnen Sie sie, wenn die Dichte das Zählen nicht zulässt. Notieren Sie die Anzahl der knospenden und nicht knospenden Zellen zu jedem Zeitpunkt. Berechnen Sie den Prozentsatz der knospenden Zellen und zeichnen Sie für jeden Zeitpunkt in einer knospenden Kurve.
      HINWEIS: Es stehen andere Methoden zur Angabe der Zellzyklus-Phaseninformationen zur Verfügung, die jedoch in diesem Protokoll nicht beschrieben werden. Die anderen Methoden sind in der CLOCCS-Readme und in einer früheren Arbeit¹¹ beschrieben.
3. Wenn Sie durchflusszytometrische DNA-Gehaltsdaten als Zellzyklusphasendaten verwenden, erfassen Sie durchflusszytometrische DNA-Färbedaten für die durchflusszytometrische CLOCCS-Ausrichtung.
   1. Stichprobe während der gesamten Zeitreihe. Sammeln Sie für jeden Zeitpunkt Zellen und fixieren Sie sie, wie in Haase und Reed²⁰ beschrieben.
   2. Färben Sie die DNA und analysieren Sie sie mit der durchflusszytometrischen Standardanalyse. Ein empfohlenes Färbeprotokoll für S. cerevisiae ist in Haase und Reed²⁰ beschrieben.
4. Sammeln Sie zugehörige Omics oder zugehörige experimentelle Daten. Für Standard-Transkriptomdaten sammeln Sie wie in Leman et ^al.18 und Kelliher et ^al.21,22 beschrieben. Stellen Sie sicher, dass die Daten mit Zeitpunkten verknüpft sind, die Phasendaten des Zellzyklus enthalten, um eine nachgelagerte Ausrichtung zu ermöglichen. Stellen Sie für eine optimale Ausrichtung sicher, dass jedem Zeitpunkt, der experimentelle Daten enthält, auch Phasendaten zugeordnet sind.
   HINWEIS: Die experimentellen Daten können viele Formen annehmen. Traditionell verwenden wir die beschriebene Alignment-Methode für die Ausrichtung von Zeitreihen-Transkriptom-Experimenten. Jede Art von Daten, die mit Zeitpunkten verknüpft sind, kann jedoch abgeglichen werden (z. B. Proteomik²²).

2. Installation der erforderlichen Software

HINWEIS: In diesem Abschnitt wird davon ausgegangen, dass Conda, Java 19 und Git bereits installiert sind (Materialtabelle).

1. Laden Sie das CLOCCS_alignment Repository herunter, indem Sie den folgenden Befehl in das Terminal eingeben:
   git clone git clone https://gitlab.com/haase-lab-group/cloccs_alignment.git
2. Erstellen Sie eine Conda-Umgebung mithilfe der Datei conda_req.yml, indem Sie den folgenden Befehl in das Terminal in dem Ordner eingeben, in dem das CLOCCS_alignment Repository geklont wurde:
   conda env create -f conda_req.yml

3. Verwendung von CLOCCS zur Parametrisierung der Experimente

1. Doppelklicken Sie auf die cloccs_v2023.jar Datei im Ordner CLOCCS im CLOCCS_alignment Repository, und warten Sie, bis eine grafische Benutzeroberfläche geöffnet wird. Dieser Bildschirm ermöglicht die Eingabe von Optionen für den CLOCCS-Lauf und zeigt die Ergebnisse nach der Ausführung an.
2. Geben Sie die allgemeinen Einstellungen ein.
   1. Legen Sie Sim Anneal, Burn In und Iterationen fest, indem Sie in die zugehörigen Texteingabefelder tippen. Sim Anneal (simuliertes Glühen) identifiziert gute Startparameterwerte, Burn In sucht nach A-posteriori-Moden und die letzte Stufe ermöglicht es, alle A-posteriori-Inferenzen zu ziehen. Höhere Werte erhöhen die Laufzeit, erhöhen aber auch die Genauigkeit.
   2. Geben Sie die Versuchsbedingungen ein, indem Sie die Temperatur in Celsius und die Synchronisationsmethode über das Textfeld Temperatur und das Dropdown-Menü Synchro angeben. Methode.
   3. Optional können Sie die erweiterten Einstellungen im Menü "Erweiterte Einstellungen" konfigurieren. Die erweiterten Einstellungen ermöglichen das Setzen von Prioritäten für jeden der Parameter ("mu0", "sigma0", "sigmav", "lambda", "bud.start", "bud.end").
      HINWEIS: Weitere Informationen zu den erweiterten Einstellungen finden Sie in der Readme.txt im Ordner CLOCCS des CLOCCS_alignment-Repositorys.
3. Geben Sie die Einstellungen für die Verwendung mit den knospenden Daten ein.
   1. Wählen Sie die entsprechende Auswahl aus dem Dropdown-Menü Modelltyp aus. Die Standardoption Bud ist für Standard-Knospeninformationen für knospende Hefe.
      HINWEIS: Im Dropdown-Menü gibt es auch andere, erweiterte Optionen: Mutant für Knospungsinformationen für Mutanten, die mehrere Knospungszyklen ohne Teilung durchlaufen, BudSSLSMR für Knospungsinformationen und zusätzliche Informationen über den Spindelpolkörper und den Myosinring und BudNucDivNeck für Knospungsinformationen und zusätzliche Informationen zur Teilung und zum Knospenhalskern. Diese erweiterten Optionen sind in der CLOCCS-Readme-Datei und in früheren Arbeiten^11,14,15 beschrieben.
   2. Importieren Sie die Daten mithilfe des Bedienfelds "Datenimport", indem Sie sie in die Texteingabefelder eingeben oder eine Datei hochladen, indem Sie auf die Schaltfläche " Datei auswählen" klicken. Die erste Spalte gibt die Zeitpunkte an. Die verbleibenden zwei Spalten geben die Daten an, die sich entwickeln, und können eine der folgenden Optionen annehmen: die Anzahl der nicht knospenden Zellen (keine Knospe), die Anzahl der knospenden Zellen (Knospe) oder die Gesamtzahl der Zellen (Total).
4. Geben Sie die Einstellungen für die Verwendung mit den durchflusszytometrischen Daten ein. Führen Sie für jedes Experiment entweder Schritt 3.3 oder Schritt 3.4 aus.
   HINWEIS: Durchflusszytometrische Daten und knospende Daten können zusammen verwendet werden. Obwohl wir zuvor beschrieben haben, dass sie zusammen^{ausgeführt werden 15}, müssen sie für dieses Tool unabhängig voneinander ausgeführt und dann verglichen werden.
   1. Konvertieren Sie die FCS-Dateien in das richtige CLOCCS-Eingabeformat für die Durchflusszytometrie, indem Sie die Anweisungen in Ergänzende Datei 1 befolgen (auch im CLOCCS_alignment-Repository als CLOCCS/flow_cytometry_conversion_instructions.txt zu finden).
   2. Wählen Sie die Flow-Auswahl aus dem Dropdown-Menü Modelltyp aus.
   3. Importieren Sie die Daten mithilfe des Bedienfelds "Datenimport". Klicken Sie auf Datei auswählen und wählen Sie die in Schritt 3.4.1 generierte Datei aus.
   4. Wählen Sie die Zeitpunkte aus, für die eine durchflusszytometrische CLOCCS-Anpassung dargestellt werden soll, indem Sie die Zeitpunkte im Feld Zeiten für die Anpassung auswählen.
5. Sobald alle Eingänge entweder für die Knospung oder die Durchflusszytometrie ausgewählt wurden, klicken Sie auf die Schaltfläche Anwenden und dann auf die Schaltfläche Probe oben auf dem Bildschirm.
6. Zeigen Sie die Knospenkurve oder die Durchflusszytometriediagramme mit den vorhergesagten Anpassungen an, indem Sie die Registerkarte Vorhergesagte Anpassungen auswählen. Diese Registerkarte wird standardmäßig unmittelbar nach dem vorherigen Schritt geöffnet.
7. Zeigen Sie die Parameterhistogramme für jeden Parameter an, indem Sie die Registerkarte Parameterhistogramme auswählen und dann aus den folgenden Optionen die Unterregisterkarte auswählen, die dem gewünschten Parameter entspricht: mu0, delta, sigma0, sigmav, lambda, bud.start, bud.end usw.
8. Zeigen Sie das Diagramm der A-posteriori-Partitur an, indem Sie die Registerkarte A-posteriori-Score auswählen.
9. Zeigen Sie die Einstellungen an und ändern Sie sie weiter, indem Sie die Registerkarte Einstellungen auswählen. Zeigen Sie das Protokoll der vorherigen Ausführungen an, indem Sie die Registerkarte Protokoll auswählen.
10. Rufen Sie die CLOCCS-Parameter aus der Anpassung ab, indem Sie die Registerkarte A-posteriori-Parameter auswählen. Die resultierende Tabelle hat die folgende Form: Jede Zeile besteht aus einem Parameter, wobei die letzte Zeile die hintere ist. Die Spalten bestehen aus dem vorhergesagten Parameter für den Mittelwert, dem unteren Konfidenzintervall von 2,5 %, dem oberen Konfidenzintervall von 97,5 % und der Akzeptanzrate.
    1. Notieren Sie die Parameter, die für die Ausrichtung für jedes Experiment verwendet werden: die Erholungszeit von der Synchronität (μ₀) und die durchschnittliche Zellzykluszeit der Mutterzellen (λ).
    2. Berechnen Sie die Zellzyklusperiode, indem Sie den Durchschnitt der Mutterzellperiode (λ) und der Tochterzellperiode (λ + δ) berechnen, wobei δ die tochterspezifische Verzögerung ist.
       Anmerkungen: Wiederholen Sie Abschnitt 3 mit allen Experimenten, die in die Vergleiche einbezogen werden sollen.

4. Konvertierung von Zeitpunkten in Lebenslinienpunkte mit den Python-Konvertierungsfunktionen und den CLOCCS-Parametern

HINWEIS: Für die Umrechnung zwischen Zeitpunkten und Lebenslinienpunkten sind zwei Umrechnungsformeln²¹ erforderlich. Eine Python-Implementierung für die Konvertierung und Datenvisualisierung ist im CLOCCS_alignment Repository verfügbar und wird im Folgenden beschrieben.

1. Aktivieren Sie die Conda-Umgebung, indem Sie den folgenden Befehl in das Terminal eingeben: conda activate CLOCCS_alignment
2. Öffnen Sie ein interaktives Python-Notebook, indem Sie den folgenden Befehl in das Terminal eingeben: jupyter notebook
3. Erstellen Sie ein neues Python-Notebook im gewünschten Ordner.
   Hinweis: Ein Beispiel-Notebook wurde zur Veranschaulichung der Standardverwendung beigefügt und befindet sich in Alignment/JOVE_example.ipynb im CLOCCS_-Ausrichtungsrepository.
4. Importieren Sie die Python-Datei mit den Ausrichtungsfunktionen, indem Sie den folgenden Befehl in der ersten Zelle ausführen:
   %run path_to_repo/cloccs_alignment/Alignment/utilities.py
   1. Ersetzen Sie path_to_repo durch den Pfad zum CLOCCS_alignment Repository.
5. Wenn Sie Knospendaten als Phasendaten des Zellzyklus verwenden, importieren Sie einen Datenrahmen, der den Prozentsatz enthält, der zu jedem Zeitpunkt geknospet wurde, indem Sie den folgenden Befehl in einer neuen Zelle ausführen:
   budding_df = pd.read_csv("path_to_folder/budding_filename.tsv", sep ="\t", index_col=0)
   1. Ersetzen Sie den entsprechenden Dateipfad und Dateinamen. Wenn es sich bei der Datei um eine .csv Datei handelt, entfernen Sie sep ="\t"
6. Wenn Sie Knospendaten als Zellzyklusphasendaten verwenden, richten Sie die Knospendaten an einer Zeitskala für Lebenslinienpunkte aus, indem Sie die folgende Funktion in eine neue Zelle eingeben:
   aligned_budding_df = df_conversion_from_parameters(budding_df, Zeitpunkte, param_mu0, param_lambda)
   1. Ersetzen Sie Zeitpunkte durch eine Liste der Zeitpunkte, die als Index des budding_df Datenrahmens dienen sollen.
   2. Für param_mu0 und param_lambda ersetzen Sie das Experiment durch die gelernten Parameter aus dem angehenden CLOCCS-Lauf.
7. Wenn Sie Durchflusszytometriedaten verwenden, importieren Sie die Durchflusszytometriedaten, indem Sie den folgenden Befehl in einer neuen Zelle ausführen:
   flow_samples = flow_cytometry_import(flow_input_folder)
   1. Ersetzen Sie flow_input_folder durch den entsprechenden Pfad zu dem Ordner, der die .fcs-Dateien für die Durchflusszytometrie enthält.
8. Wenn Sie Durchflusszytometriedaten verwenden, generieren Sie für jedes Experiment eine Umrechnungstabelle zwischen den Zeitpunkten und Lebenslinienpunkten, indem Sie den folgenden Befehl in eine neue Zelle eingeben:
   flow_converter = convert_tp_to_ll(Zeitpunkte, param_mu0, param_lambda)
   1. Ersetzen Sie Zeitpunkte durch eine Liste der Zeitpunkte aus den Durchflusszytometriedaten.
   2. Für param_mu0 und param_lambda ersetzen Sie das Experiment durch die erlernten Parameter aus der Durchflusszytometrie, die CLOCCS in Abschnitt 3 durchgeführt hat.
9. Importieren Sie den Datenrahmen, der die experimentellen Daten enthält, in das Notebook, indem Sie den folgenden Befehl in einer neuen Zelle ausführen:
   data_df = pd.read_csv("path_to_folder/exp_data_filename.tsv", sep ="\t", index_col=0)
   1. Ersetzen Sie den entsprechenden Dateipfad und Dateinamen. Wenn es sich bei der Datei um eine .csv Datei handelt, entfernen Sie sep ="\t".
      HINWEIS: Dies kann für alle tabellarischen Daten erfolgen. Die experimentellen Daten müssen lediglich die Zeitpunkte entweder als Spalten oder als Index des Datenrahmens aufweisen. Beispieldaten finden Sie im CLOCCS_alignment Repository.
10. Richten Sie die experimentellen Daten an einer Zeitskala eines Lebenslinienpunkts aus, indem Sie die folgende Funktion in eine neue Zelle eingeben:
    lifeline_aligned_df = df_conversion_from_parameters(data_df, Zeitpunkte, param_mu0, param_lambda, interpolieren, lowerll, upperll)
    1. Ersetzen Sie Zeitpunkte durch eine Liste der Zeitpunkte als Index oder Spalten der experimentellen data_df aus dem vorherigen Schritt.
    2. Für param_mu0 und param_lambda sind die Werte in Abschnitt 3 von CLOCCS zu verwenden.
       HINWEIS: Die Parameter können aus jedem CLOCCS-Lauf stammen, der für einen der akzeptierten Zellzyklusphasen-Datentypen ausgeführt wird.
    3. Optional können Sie interpolieren durch "True" oder "False" ersetzen oder das Feld leer lassen (der Standardwert ist "False").
       HINWEIS: Wenn diese Einstellung auf " False" festgelegt ist, werden die Daten nicht interpoliert. Wenn der Wert auf True festgelegt ist, werden die Lebenslinienpunkte gerundet und interpoliert, um die Werte zwischen den Lebenslinienpunkten auszufüllen, sodass ein Punkt pro Ganzzahl im Bereich der Lebenslinienpunkte vorhanden ist. Dies ermöglicht einen besseren Vergleich zwischen Datensätzen.
    4. Ersetzen Sie optional lowerll und upperll durch None oder ganzzahlige Werte.
       HINWEIS: Wenn diese Option auf "Keine" festgelegt ist, werden alle Lebenslinienpunkte nach der Interpolation beibehalten. Wenn ganze Zahlen angegeben werden, werden die Daten abgeschnitten, sodass die Lebenslinienpunkte vom unteren zum oberen Bereich reichen. Dies ermöglicht den Vergleich zwischen Datensätzen mit einem anderen Unter- oder Oberteil.
11. Laden Sie das an der Lebenslinie ausgerichtete Dataset herunter, indem Sie den folgenden Befehl in eine neue Zelle eingeben: lifeline_aligned_df.to_csv("path_to_desired_location/name_of_file.tsv", sep = "\t")
12. Wiederholen Sie die Schritte 4.5-4.11 mit allen Experimenten, die in die Vergleiche einbezogen werden sollen.

5. Vergleich von Knospkurven und Durchflusszytometriedaten

1. Zeichnen Sie die knospenden Kurven vor der Ausrichtung mit der Python-Dienstprogrammfunktion, indem Sie den folgenden Befehl in eine neue Zelle eingeben:
   plot_budding_curves(list_of_budding_curves, list_for_legend = leg_list, point_type = str_type, Titel = str_title)
   1. Ersetzen Sie eine Liste mit den Datenrahmen aller gewünschten knospenden Kurven zum Zeichnen von list_of_budding_curves-[bud_df1, bud_df2, bud_df3].
   2. Ersetzen Sie bei Bedarf eine Liste der Beschriftungen für die Legende [Experiment 1, Experiment 2, Mutant] durch leg_list. Ist dies nicht der Fall, schließen Sie None aus oder ersetzen Sie Keine.
   3. Ersatzzeit für str_type.
   4. Ersetzen Sie str_title bei Bedarf durch einen Zeichenfolgentitel Comparison Budding Curves . Wenn nicht, ersetzen Sie "Keine" oder schließen Sie es aus.
2. Zeichnen Sie die knospenden Kurven nach der Ausrichtung mit der Python-Dienstprogrammfunktion, indem Sie die Anweisungen in Schritt 5.1 befolgen, jedoch mit einer Liste der ausgerichteten knospenden Kurven, die durch list_of_budding_curves ersetzt werden, und mit einer Lebenslinie für point_type anstelle von Zeit.
3. Um die Durchflusszytometriedaten darzustellen, zeichnen Sie die zugehörigen Daten aus den .fcs-Dateien an den entsprechenden Lebenslinienpunkten mit dem in Schritt 4.8 generierten Konverter auf.
4. Konvertieren Sie die Seilsicherungspunkte mithilfe der Konvertertabelle in die Zellenzyklusphase (Tabelle 1).
   HINWEIS: Dies kann auch geplottet werden, indem Sie den Anweisungen in Schritt 5.1 folgen, jedoch mit Phase für point_type anstelle von Zeit.

6. Vergleich der experimentellen Daten

1. Bestimmen Sie die Genliste, die in den Liniendiagrammen dargestellt werden soll, basierend auf Literaturinformationen oder den Genen, die für die Forschung von Interesse sind.
2. Verwenden Sie die in der Python-Dienstprogrammdatei bereitgestellten plot_linegraph_comparison, um Liniendiagrammvergleiche für den ursprünglichen, ausgerichteten oder ausgerichteten und interpolierten Datenrahmen durchzuführen, indem Sie den folgenden Befehl in eine neue Zelle eingeben:
   plot_linegraph_comparison(list_of_dfs, list_for_legend, Genelist, point_type = str_type, Titel = str_title)
   1. Ersetzen Sie list_of_dfs durch eine Liste der Datenrahmen der zu vergleichenden Experimente.
      HINWEIS: Die Datenrahmen können nicht ausgerichtet oder ausgerichtet sein. Die entsprechenden point_type müssen jedoch in Schritt 6.2.4 eingegeben werden.
   2. Ersetzen Sie eine Liste der Titel für jeden Datenrahmen in der gleichen Reihenfolge wie die Liste der Datenrahmen für list_for_legend.
   3. Ersetzen Sie eine Liste der Gennamen (die im Index der Datenrahmen enthalten sein müssen), die für die Geneliste dargestellt werden sollen.
   4. Ersetzen Sie str_type durch den Punkttyp. Verwenden Sie die Lebenslinie (die Standardeinstellung ist die Lebenslinienpunktskala) oder die Phase (die Lebenslinienskala der Zellzyklusphase) für die ausgerichteten Datenrahmen in Schritt 6.2.1 oder die Zeit für die nicht ausgerichteten Datenrahmen in Schritt 6.2.1.
   5. Ersetzen Sie str_title durch einen optionalen Zeichenfolgentitel.
3. Bestimmen Sie die Genliste, die in die Heatmap aufgenommen werden soll, indem Sie die Literatur oder Algorithmen verwenden, um die wichtigsten periodischen Gene zu bestimmen.
   HINWEIS: Für ordnungsgemäße Heatmap-Vergleiche sollten die Daten in Schritt 6.2 ausgerichtet, interpoliert und zeitskalisch angepasst werden. Es sollte für jedes Experiment den gleichen Start- und Endwert für die Lebenslinie haben.
   1. Führen Sie Periodizitätsalgorithmen aus, um die wichtigsten periodischen Gene^23,24 zu bestimmen^, oder verwenden Sie die gewünschten alternativen Methoden, um die Genliste (d. h. Literaturergebnisse) zu bestimmen.
   2. Importieren Sie eine .csv- oder TSV-Genlistendatei in das Notizbuch, indem Sie den folgenden Befehl in eine neue Zelle verwenden:
      sort_df = pd.read_csv("path_to_folder/sorting_filename.tsv", sep="\t", index_col=0)
   3. Ersetzen Sie den entsprechenden Dateipfad und Dateinamen. Wenn es sich bei der Datei um eine .csv Datei handelt, entfernen Sie sep="\t".
4. Verwenden Sie die bereitgestellte Funktion plot_heatmap_comparison in der Python-Dienstprogrammdatei, um einen Heatmap-Vergleich für den ausgerichteten, interpolierten und phasenausgerichteten Datenrahmen durchzuführen, indem Sie den folgenden Befehl in eine neue Zelle eingeben:
   plot_heatmap_comparison(list_of_dfs, list_for_legend, Genelist, Titel = str_title)
   1. Ersetzen Sie list_of_dfs durch eine Liste der ausgerichteten Datenrahmen der zu vergleichenden Experimente.
   2. Ersetzen Sie eine Liste der Titel für jeden Datenrahmen in der gleichen Reihenfolge wie die Liste der Datenrahmen für list_for_legend.
   3. Ersetzen Sie eine Liste der Gennamen (die im Index der Datenrahmen enthalten sein müssen), die für die Geneliste dargestellt werden sollen.
   4. Ersetzen Sie str_title durch einen optionalen Zeichenfolgentitel.
      HINWEIS: Der erste Datenrahmen in der Liste ist derjenige, der für die Sortierung der Gene in der Heatmap verwendet wird. Die Gene werden in der ersten Periode für diesen Datenrahmen nach dem Maximum sortiert, und die gleiche Reihenfolge wird für die nachfolgenden Datenrahmen in der Liste verwendet.

Ergebnisse

Die im obigen Protokoll und im Workflow in Abbildung 1 beschriebenen Schritte wurden auf fünf Zellzyklus-synchronisierte Zeitreihenexperimente angewendet, um zwei repräsentative Vergleiche zu demonstrieren: zwischen Replikaten mit unterschiedlichen Synchronitätsmethoden (Paarungspheromon und zentrifugale Elutriierung¹⁸) und Sequenzierungsplattformen (RNA-Sequenzierung [RNA-seq] und Microarray) sowie zwischen experimentellen Bedingungen. Es wurden mehrere Experi...

Diskussion

In dieser Arbeit wird eine Methode vorgestellt, mit der Daten aus Zeitreihenexperimenten an synchronisierten Zellpopulationen genauer und quantitativ ausgewertet werden können. Die Methode verwendet erlernte Parameter von CLOCCS, einem Bayes'schen Inferenzmodell, das Eingabedaten der Zellzyklusphase, wie z. B. Knospungsdaten und durchflusszytometrische DNA-Inhaltsdaten, verwendet, um jedes Experiment zu parametrisieren^14,15. CLOCCS verwendet die eingegebenen Zel...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2x PBS			For Fixative Solution. Described in Leman 2014.
4% formaldehyde			For Fixative Solution.
100% Ethanol			For flow cytometry fixation. Described in Haase 2002.
CLOCCS			https://gitlab.com/haase-lab-group/cloccs_alignment.git
Flow Cytometer			For flow cytometry protocol.
Git			https://git-scm.com/
Java 19			https://www.oracle.com/java/technologies/downloads/#java19
Microscope			For counting cells and buds.
Miniconda			https://docs.conda.io/en/latest/
Protease solution			For flow cytometry protocol. Described in Haase 2002.
RNAse A solution			For flow cytometry protocol. Described in Haase 2002.
SYTOX Green Nucleic Acid Stain	Invitrogen	S7020	For flow cytometry staining. Described in Haase 2002.
Tris			pH 7.5