Os inibidores de checkpoint são alvos importantes no desenvolvimento de terapias para a batalha contra o câncer. Este relatório apresenta uma nova vacina contra o câncer baseada em peptídeo PDL1, PDL1-Vaxx, que induz a produção de anticorpos policlonais neutralizantes que bloqueia a formação do complexo PD-1/PDL1. Este trabalho também detalha o desenvolvimento e teste de um ensaio baseado em esferas fluorescentes para análise desta atividade.
A inibição dos receptores de checkpoint (PD-1, PD-L1 e CTLA-4) com anticorpos monoclonais tem mostrado grande benefício em ensaios clínicos para o tratamento de pacientes com câncer e tornou-se uma abordagem fundamental na imunoterapia moderna contra o câncer. No entanto, apenas um subgrupo de pacientes responde à imunoterapia com anticorpos monoclonais de checkpoint. Portanto, é urgente o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas contra o câncer. Uma nova vacina contra o câncer PDL1 (ligante de morte programada 1) do epítopo de células B foi desenvolvida, com aminoácidos 130-147 ligados ao peptídeo MVF (proteína de fusão do vírus do sarampo de células T "promíscua") através de um ligante GPSL. Testes pré-clínicos indicaram que esta vacina PDL1 (PDL1-Vaxx) estimula efetivamente anticorpos altamente imunogênicos em animais. Animais imunizados com PDL1-Vaxx apresentam carga tumoral reduzida e taxas de sobrevida prolongadas em vários modelos de câncer animal. Os mecanismos de ação indicam que os anticorpos induzidos pela vacina inibem a proliferação de células tumorais, induzem apoptose e bloqueiam a interação PD-1/PD-L1. Este manuscrito apresenta um ensaio baseado em esferas magnéticas que usa um sistema de análise de fluxo dual-reporter para avaliar a interação PD-1/PD-L1 e seu bloqueio pelos anticorpos anti-PDL1 levantados contra o PDL1-Vaxx.
Nas células T, células B e checkpoints intracelulares do sistema imunológico, as vias de sinalização regulam as atividades imunológicas. Algumas células cancerosas se protegem do ataque imunológico estimulando alvos de checkpoint, que inibem a função imune e promovem a sobrevivência e proliferação neoplásica. A imunoterapia oncológica por inibição de checkpoints utiliza anticorpos para atingir e bloquear os pontos de verificação de sinalização e, assim, restaurar as funções antineoplásicas do sistema imune 1,2,3. Terapias antineoplásicas altamente eficazes atualmente incluem os anticorpos monoclonais nivolumab, que tem como alvo a proteína de morte programada 1 (PD-1)4, e atezolizumabe, que tem como alvo o ligante de morte programada 1 (PD-L1)5. Essa abordagem tem mostrado grande sucesso clínico no tratamento de pacientes oncológicos. No entanto, a utilidade clínica das atuais estratégias de inibição de checkpoints é atenuada por eventos adversos e resistência ao tratamento, especialmente na terapia com agente único6. Uma combinação de imunoterapia e estratégias terapêuticas mais efetivas com menor toxicidade é urgentemente necessária no tratamento do câncer 1,3,6.
Nos últimos 30 anos, o laboratório do Dr. Kaumaya desenvolveu vacinas peptídicas contra o câncer e agentes relacionados à mimética de peptídeos para a terapia do câncer, alguns dos quais estão em ensaios clínicos em andamento 1,2,7,8,9,10,11,12,13,14 . Por exemplo, a imunoterapia combinada B-Vaxx com HER-2 demonstrou benefícios para os pacientes contra tumores sólidos metastáticos e/ou recorrentes em ensaios clínicos12. As vacinas contra o câncer mais recentes do laboratório são PD1-Vaxx 2,13 e PDL1-Vaxx14, que têm mostrado grandes vantagens em estudos pré-clínicos, especialmente no tratamento combinado. O PD1-Vaxx concluiu ensaios clínicos de escalonamento de dose nos EUA e na Austrália. O PD1-Vaxx será combinado com atezolizumabe no ensaio de Fase 1b a ser iniciado em maio de 2023. Este relatório concentra-se em avaliar a capacidade dos anticorpos induzidos por PDL1-Vaxx de bloquear a interação PD-1/PD-L1.
A vacina contra o câncer PDL1-Vaxx é uma nova vacina de epítopo de peptídeo de células B com aminoácidos PD-L1 130-147 ligados ao peptídeo promíscuo de fusão do vírus do sarampo de células T (MVF) através de um ligante de peptídeo GPSL. Estudos pré-clínicos demonstraram que o PDL1-Vaxx é altamente imunogênico ao estimular a produção de anticorpos anticâncer em vários modelos animais, prolonga a sobrevida e reduz a carga tumoral14. Esses anticorpos gerados contra o peptídeo PD-L1 podem bloquear com sucesso a interação PD1/PD-L1, resultando em atividade antineoplásica. Este relato apresenta um ensaio que analisa o bloqueio da formação do complexo PD1/PD-L1 por anticorpos induzidos por PDL1-Vaxx usando um formato baseado em esferas magnéticas com uma leitura de dois repórteres em um instrumento de citometria de fluxo.
1. Preparação experimental
NOTA: Os detalhes de todos os reagentes/equipamentos mencionados nesta etapa estão listados na Tabela de Materiais.
2. Acoplamento rhPD-1 a esferas magnéticas
NOTA: A proteína a ser acoplada deve estar isenta de albumina de soro bovino (BSA), azida sódica, glicina, glicerol, tris(hidroximetil)aminometano (Tris) ou aditivos contendo amina e deve ser suspensa em PBS em pH 7,4. Está disponível um kit de acoplamento comercial que inclui todos os reagentes e buffers necessários descritos aqui (consulte a Tabela de Materiais).
3. Avaliação do sucesso do acoplamento rhPD-1 às esferas
NOTA: As microesferas acopladas a rhPD-1 reagem com rhPD-L1 biotinilado, sendo este último detectado por incubação com SAPE seguido de uma avaliação no citômetro de fluxo. Isso verifica tanto o acoplamento bem sucedido do PD-1 às esferas magnéticas quanto a interação funcional entre as proteínas rhPD-1 e rhPD-L1.
4. PD-L1 ensaio de bloqueio PD-1/PD-L1 baseado em esferas magnéticas
NOTA: Este ensaio avalia a atividade de bloqueio de mediadores solúveis (por exemplo, anticorpos anti-PDL1-peptídeo) em interações PD1/PD-L1 recombinantes. Resumidamente, rhPD-L1 biotinilado é pré-incubado com anticorpos gerados em coelhos após diferentes inoculações do peptídeo PDL1-Vaxx. A mistura de anticorpos rhPD-L1 + anti-PDL1 é então capturada usando esferas magnéticas acopladas a rhPD-1, e a ligação de rhPD-L1 às esferas acopladas a rhPD-1 é quantificada pela adição de estreptavidina-PE. O sinal de fluorescência do PE correlaciona-se inversamente com a atividade bloqueadora dos anticorpos/inibidores anti-PDL1 testados. A ligação do anticorpo anti-peptídeo PDL1 é avaliada simultaneamente pela ligação de um anticorpo secundário anti-coelho acoplado a BV421 (para anticorpos antipeptídeo anti-PDL1) ou anti-humano (para anticorpos de controle) e pela avaliação da fluorescência BV421 no segundo canal do instrumento. As etapas do ensaio estão pictoricamente detalhadas na Figura 1.
Figura 1: Esquema do ensaio de bloqueio PD-1/PD-L1 do repórter duplo. A PD-L1 humana recombinante biotinilada (rhPD-L1) é pré-incubada com anticorpos anti-PDL1 induzidos por PDL1-Vaxx selecionados antes de se combinar com esferas magnéticas acopladas a rhPD-1 para permitir a formação do complexo de pontos de verificação PD-1/PD-L1. A rhPD-L1 complexada é então detectada e marcada pela adição de ficoeritrina acoplada à estreptavidina (SAPE, fluoróforo de laranja). Os anticorpos contra os epítopos PDL1-Vaxx têm como alvo o rhPD-L1 que se complexou ao rhPD-1 pré-acoplado às esferas magnéticas, e eles são iluminados usando um anticorpo secundário conjugado Brilliant Violet 421 (BV421, fluoróforo azul). Tanto os anticorpos rhPD-L1 biotinilados que são complexados a PD-1 (sinal de PE) quanto os anticorpos anti-PDL1 que reconhecem e se ligam ao rhPD-L1 (sinal BV421) são analisados simultaneamente usando um instrumento de citometria de fluxo de repórter duplo que interroga amostras para ambos os fluoróforos em dois canais repórteres separados. Os valores de saída para cada amostra são a intensidade mediana da fluorescência de cada fluoróforo. A inibição da formação do complexo PD1/PD-L1 por diferentes anticorpos induzidos por PDL1-Vaxx é então extrapolada comparando-se os sinais experimentais com aqueles gerados usando um anticorpo monoclonal de controle negativo que não se liga a rhPD-L1 (0% de inibição). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
O ensaio foi capaz de quantificar precisamente a inibição da interação PD-1/PD-L1 por quatro anticorpos policlonais únicos, gerados contra os peptídeos vacinais rhPD-L1, que estão sendo explorados como potenciais agentes terapêuticos do câncer. O esquema deste ensaio é fornecido na Figura 1. A quantidade de rhPD-L1 biotinilado que se ligou a esferas conjugadas com rhPD-1 e a inibição dessa ligação pelos quatro candidatos a anticorpos induzidos por PLD1-Vaxx foi medida no Canal Reporter 1 usando um reagente de detecção de estreptavidina-PE que ligou diretamente rhPD-L1 (Figura 2).
Todos os quatro anticorpos policlonais antipeptídeo PDL1 bloquearam a interação rhPD-L1 com PD-1 que havia sido imobilizada em microesferas em extensões variáveis. A porcentagem de inibição dos diferentes anticorpos antipeptídeos anti-PDL1 variou de 48% a 74% na concentração máxima testada de 1.000 μg/mL. O anticorpo monoclonal de controle positivo atezolizumabe obteve bloqueio de 92% da interação PD-1/PD-L1 na concentração máxima testada14 de 4 μg/mL (Figura 2). Todos os anticorpos PDL1-Vaxx experimentais mostraram inibição concentração-dependente da ligação de rhPD-L1 a esferas conjugadas de rhPD-1 em comparação com trastuzumabe, o anticorpo de controle negativo que não era esperado para interagir com o sistema PD-1/PD-L1.
Figura 2: Bloqueio da interação rhPD-L1 com rhPD-1 acoplado a esferas magnéticas por anticorpos anti-PDL1-peptídeo, como mostrado por um novo imunoensaio baseado em esferas fluorescentes. PD-1 humano recombinante foi acoplado a microesferas magnéticas, e as esferas foram então incubadas com rhPD-L1 biotinilado que foi pré-incubado com diferentes anticorpos anti-PDL1-peptídeo. Um reagente de detecção de estreptavidina-ficoeritrina foi usado para ligar a biotina e, assim, avaliar a quantidade relativa de rhPD-L1 que estava disponível para se ligar à PD-1. Anticorpos policlonais criados em coelhos contra as vacinas do peptídeo PDL1 (anti-PDL1[36], anti-PDL1[50], anti-PDL1[95] e anti-PDL1[130]) foram testados quanto à atividade inibitória e mostraram bloqueio de 48%-74% das interações PD-1/PD-L1 recombinante na maior concentração testada. Atezolizumabe (outro anticorpo monoclonal anti-PDL1) foi utilizado como controle positivo. O anticorpo monoclonal comercial não relacionado trastuzumabe (anti-HER2) foi usado como controle negativo. Esse dado é adaptado de Guo et al.14. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Ligação comparativa de diferentes anticorpos induzidos por PDL1-Vaxx a rhPD-L1 complexados a esferas magnéticas revestidas com rhPD1. O anticorpo de detecção secundária conjugado violeta brilhante 421 foi usado para comparar a ligação de diferentes anticorpos policlonais anti-PDL1-peptídeo de coelho a rhPD-L1 via esferas revestidas com rhPD-1. O sinal de fluorescência azul BV421 foi registrado no Canal Repórter 2 do instrumento dual-repórter; esse sinal correlaciona-se com a eficiência relativa de ligação dos anticorpos experimentais anti-PDL1-peptídeo. Trastezumab (anti-HER2), um anticorpo monoclonal que tem como alvo um checkpoint diferente de PD-1/PD-L1, foi usado como controle negativo. A MFI representa a intensidade média de fluorescência mediana do cordão, que foi medida em poços de reação duplicados por condição. Esse dado é adaptado de Guo et al.14. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
As habilidades relativas dos quatro anticorpos candidatos experimentais induzidos por PDL1-Vaxx para se ligarem a rhPD-L1 foram comparadas usando um sistema de detecção separado (IgG anticoelho conjugado BV421) que foi avaliado no segundo canal repórter do instrumento. Esses resultados indicaram que todos os quatro anticorpos policlonais antipeptídeo PDL1 se ligaram à rhPD-L1 de forma concentração-dependente14 (Figura 3). O anticorpo anti-PDL1(130) mostrou o maior sinal de ligação rhPDL1 dos quatro candidatos a anticorpos induzidos por PDL1-Vaxx.
O objetivo da imunoterapia do câncer relacionado a checkpoints é interromper a interação entre proteínas de checkpoint e seus ligantes importantes na sobrevivência e progressão tumoral2. Este grupo de pesquisa está desenvolvendo ativamente novas vacinas PD-1 e PD-L1 que provocam uma resposta de anticorpos que tem como alvo e interrompe o checkpoint PD-1/PD-L1 3,8,13,14. Previamente, duas variações de ensaios imunoenzimáticos (ELISAs) foram realizadas para avaliar os efeitos de anticorpos antipeptídeos anti-PDL1 na inibição da interação PD1/PD-L1 recombinante14. (1) Na primeira variante, rhPD-L1 foi revestida em uma placa de microtitulação e, em seguida, a placa foi incubada com anticorpos diluídos anti-PDL1 candidatos à vacina induzidos. A inibição da interação PD-1/PD-L1 recombinante pelos anticorpos foi então avaliada pela adição de rhPD-1 biotinilado e quantificação da ligação à rhPD-L1 imobilizada usando um conjugado estreptavidina-peroxidase de raiz forte e um substrato colorimétrico. Definimos isso como o ensaio de bloqueio direto. (2) Na segunda variante, PD-1 foi revestida na placa de microtitulação. rhPD-L1 biotinilado foi pré-incubado com cada um dos anticorpos policlonais induzidos por candidatos anti-PLD1 em tubos de reação separados. As misturas rhPDL1/anti-PDL1 foram então adicionadas aos poços de placas contendo rhPD-1 imobilizado e deixadas reagir. Qualquer rhPDL1 que reagiu com o rhPD-1 imobilizado na presença de anticorpos potencialmente bloqueadores induzidos por PDL1-Vaxx foi detectado com subsequente incubação de estreptavidina-HRP e substrato colorimétrico. Definimos isso como o ensaio de bloqueio reverso.
O bloqueio reverso da interação PD-1/PD-L1 recombinante por anticorpos antipeptídeos PDL1 mostrou inibição do sinal (i.e., bloqueio PD-1/PD-L1) de forma dependente da concentração de anticorpos14, enquanto a abordagem de bloqueio direto não forneceu resultados consistentes (não mostrados). O ensaio de bloqueio dual-reporter baseado em contas foi desenvolvido para verificar os resultados do ELISA e investigar o bloqueio da interação PD-1/PD-L1 em uma fase fluida, o que elimina os potenciais problemas de impedimento estérico/disponibilidade de epítopos de ligação associados à imobilização de proteínas recombinantes em fundos de poços. A análise da microesfera correlacionou-se diretamente com os resultados de bloqueio do ELISA pelo ensaio de bloqueio reverso (Figura 2). Além disso, os imunoensaios baseados em fluorescência podem fornecer melhor sensibilidade ao ensaio e uma faixa dinâmica ampliada em comparação com ELISAs colorimétricos18 e, além disso, o ensaio multiplexado baseado em esferas permite o desempenho simultâneo de dois imunoensaios independentes dentro de uma única reação. O sulfo-NHS e o EDC usados para o acoplamento covalente das microesferas ao rhPD-1 podem ter levado às diferenças de desempenho observadas entre os ensaios de bloqueio direto e bloqueio reverso e as diferenças observadas na sensibilidade entre os ensaios de interação PD-1/PD-L1 recombinante baseados em esferas ELISA e Luminex. Mais investigações em nível químico e molecular são necessárias para estudar os possíveis mecanismos responsáveis por essas diferenças.
Tanto o ELISA14 quanto os ensaios baseados em esferas demonstram que os anticorpos anti-PDL1-Vaxx-induzidos por PDL1 podem inibir a formação do complexo PD1/PD-L1. O PDL1-Vaxx baseado em peptídeo induz com sucesso anticorpos anti-PDL1 que podem bloquear a interação PD-1/PD-L1. Essa abordagem pode servir como uma nova estratégia terapêutica para o tratamento do câncer, como apoiado por estudos pré-clínicos em animais3,13,14. Ensaios clínicos planejados determinarão a eficácia do PDL1-Vaxx para imunoterapia de checkpoint e controle da doença em pacientes com câncer.
Os autores agradecem a Sherry Dunbar PhD, MBA da Luminex Corporation (Austin, TX) pelo apoio à pesquisa e Matthew Silverman PhD da Biomedical Publishing Solutions (Cidade do Panamá, FL; mattsilver@yahoo.com) pela assistência científica e de redação. Este trabalho foi apoiado por prêmios a Pravin T. P. Kaumaya do National Institutes of Health (R21 CA13508 e R01 CA84356) e Imugene Ltd, Sydney, Austrália (OSU 900600, GR110567 e GR124326).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Buffers | |||
Activation Buffer: 0.1 M NaH2PO4, pH 6.2 | Millipore/Sigma | S3139 | |
Assay/Wash Buffer: PBS-TBN (1x PBS, pH 7.4 + 0.1% BSA + 0.05 % (v/v) Tween-20; 0.05% NaN3) | Millipore/Sigma | P3563 (PBS+Tween20), A7888 (Bovine serum albumin), S8032 (sodium azide) | |
Coupling Buffer: 50 mM 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES), pH 5.0 | MilliporeSigma | M2933 | |
Coupling Reagents | |||
1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC) | ThermoFisher Scientific (Waltham, MA) | 77149 | |
xMAP Antibody Coupling Kit (if desired), includes: | Luminex Corp. (Austin, TX) | 40-50016 | |
EDC, 10 mg | |||
sNHS solution, 250 µL | |||
Activation/Coupling Buffer: 0.1 M 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES), pH 6.0 | |||
Wash Buffer: 1x PBS, pH 7.4 + 0.1% BSA + 0.05 % (v/v) Tween-20; 0.05% NaN3 (PBS-TBN) | |||
Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide) | ThermoFisher Scientific (Waltham, MA) | 24510 | |
Instrumentation and Ancillary Lab Supplies | |||
xMAP INTELLIFLEX (dual-reporter instrument) | Luminex Corp. (Austin, TX) | INTELLIFLEX-DRSE-RUO | |
Low protein-binding round bottom 96-well plate | ThermoFisher Scientific (Waltham, MA) | 07-200-761 | |
Luminex Magnetic Plate Separator (or comparable) | Luminex Corp. (Austin, TX) | CN-0269-01 | |
Luminex Magnetic Tube Separator (or comparable) | Luminex Corp. (Austin, TX) | CN-0288-01 | |
MagPlex Microspheres (magnetic, fluorescent, 6.5-µm-diameter beads) | Luminex Corp. (Austin, TX) | MC-1**** (varies by bead label) | |
Protein LoBind microcentrifuge tubes | ThermoFisher Scientific (Waltham, MA) | 022431081 | |
Peptides, Antibodies, & Detection Reagents | |||
Atezolizumab (humanized anti-PDL1 IgG1 monoclonal antibody), positive control | Genentech/Roche (San Francisco, CA) | n/a (prescription medications) | |
Biotinylated recombinant human PDL1 | Sino Biological (Wayne, PA) | 10084-H49H-B | |
Brilliant Violet 421-congugated donkey anti-human IgG | Jackson Immunoresearch Laboratories Inc. (Westgrove, PA) | 709-675-149 | |
Brilliant Violet 421-congugated donkey anti-rabbit IgG | Jackson Immunoresearch Laboratories Inc. (Westgrove, PA) | 711-675-152 | |
Recombinant human PD-1 (poly-histidine tagged) | Acro Biosystems (Newark, DE) | PD1-H5256 | |
Streptavidin-conjugated R-phycoerythrin (SAPE) | Agilent (Santa Clara, CA) | PJRS34-1 | |
Trastuzumab (Herceptin, humanized anti-HER2 monoclonal antibody), negative control | Genentech/Roche (San Francisco, CA) | n/a (prescription medications) |
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