Geração de Linhagens Celulares Knockout da Proteína Associada ao Centrômero-E CENP-E-/- utilizando o Sistema CRISPR/Cas9

Summary

Este artigo relata a construção de células knockout da proteína E associada a centrômeros (CENP-E) usando o sistema CRISPR/Cas9 e três estratégias de triagem baseadas em fenótipos. Utilizamos a linhagem celular knockout do CENP-E para estabelecer uma nova abordagem para validar a especificidade e toxicidade dos inibidores do CENP-E, o que é útil para o desenvolvimento de fármacos e pesquisa biológica.

Abstract

O sistema CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9 emergiu como uma ferramenta poderosa para edição precisa e eficiente de genes em uma variedade de organismos. A proteína-E associada ao centrômero (CENC-E) é uma cinesina direcionada a mais necessária para a captura de microtúbulos cinetócoros, alinhamento cromossômico e ponto de verificação de montagem do fuso. Embora as funções celulares das proteínas CENP-E tenham sido bem estudadas, tem sido difícil estudar as funções diretas das proteínas CENP-E usando protocolos tradicionais, porque a ablação CENP-E geralmente leva à ativação do ponto de verificação da montagem do fuso, parada do ciclo celular e morte celular. Neste estudo, nós nocauteamos completamente o gene CENP-E em células HeLa humanas e geramos com sucesso as células CENP-E^-/- HeLa usando o sistema CRISPR/Cas9.

Três estratégias otimizadas de triagem baseadas em fenótipos foram estabelecidas, incluindo triagem de colônias celulares, fenótipos de alinhamento cromossômico e intensidades fluorescentes das proteínas CENP-E, que efetivamente melhoram a eficiência de triagem e a taxa de sucesso experimental das células knockout do CENP-E . É importante ressaltar que a deleção CENP-E resulta em desalinhamento cromossômico, localização anormal das proteínas serina/treonina quinase B (BubR1) do ponto de verificação mitótico BUB1 e defeitos mitóticos. Além disso, utilizamos o modelo de células HeLa nocaute do CENP-E para desenvolver um método de identificação de inibidores específicos do CENP-E.

Neste estudo, uma abordagem útil para validar a especificidade e toxicidade dos inibidores do CENP-E foi estabelecida. Além disso, este trabalho apresenta os protocolos de edição gênica do CENP-E utilizando o sistema CRISPR/Cas9, que pode ser uma ferramenta poderosa para investigar os mecanismos do CENP-E na divisão celular. Além disso, a linhagem celular knockout do CENP-E contribuiria para a descoberta e validação dos inibidores do CENP-E, que têm implicações importantes para o desenvolvimento de drogas antitumorais, estudos de mecanismos de divisão celular em biologia celular e aplicações clínicas.

Introduction

A edição do genoma projetado medeia as modificações direcionadas de genes em uma variedade de células e organismos. Em eucariotos, a mutagênese sítio-específica pode ser introduzida pela aplicação de nucleases seqüenciais-específicas que estimulam a recombinação homóloga do DNA-alvo¹. Nos últimos anos, várias tecnologias de edição do genoma, incluindo nucleases de dedo de zinco (ZFNs)^2,3, nucleases efetoras do tipo ativador de transcrição (TALENs)^4,5 e meganucleases^homing6,7

Protocol

1. Construção dos vetores knockout do gene CRISPR/Cas9

1. Selecione a sequência de DNA genômico alvo no gene CENP-E humano (GenBank Accession No. NM_001286734.2) e projetar o sgRNA usando uma ferramenta de projeto CRISPR on-line (http://crispor.tefor.net/).
2. Insira uma única sequência genômica, selecione o genoma de "Homo sapiens-human-UCSC Dec 2013 (conjunto de análise hg38) + polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs): dbSNP148", e selecione o motivo adjacente.......

Discussion

A cinesina-7 CENP-E é um regulador chave no alinhamento cromossômico e no ponto de verificação da montagem do fuso durante a divisão celular 17,19,20. A deleção genética do CENP-E geralmente resulta na ativação do ponto de verificação da montagem do fuso, parada do ciclo celular e morte celular 27,29,51,52.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200056
1.5 mL centrifuge tube	Axygen	MCT-150-C
24-well plate	Corning	3524
4S Gelred, 10,000x in water	Sangon Biotech (Shanghai)	A616697
50 mL centrifuge tube	Corning	430828
6 cm Petri dish	Corning	430166
95% ethanol	Sinopharm Chemical Reagent	10009164
96-well plate	Corning	3599
Acetic acid	Sinopharm Chemical Reagent	10000218	Dissolve in H2O to prepare a 10% working solution.
Agarose	Sangon Biotech (Shanghai)	A620014
Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Mouse IgG(H+L)	Beyotime	A0428	For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)	Beyotime	A0423	For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Alexa Fluor 555-labeled Donkey Anti-Mouse IgG(H+L)	Beyotime	A0460	For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Anhydrous ethanol	Sinopharm Chemical Reagent	100092690
Anti-BubR1 rabbit monoclonal antibody	Abcam	ab254326	For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution
Anti-CENP-B mouse monoclonal antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-376392	For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:50 dilution.
Anti-CENP-E rabbit monoclonal antibody	Abcam	ab133583	For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution.
Anti-fade mounting medium	Beyotime	P0131	Slowing down the quenching of fluorescent signals.
Anti-α-tubulin mouse monoclonal antibody	Abcam	ab7291	For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution.
Biotek Epoch Microplate Spectrophotometer	Biotek Instruments	Biotek Epoch
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sinopharm Chemical Reagent	69003435
BpiI (BbsI)	Thermo Fisher Scientific	ER1011
CellTiter 96 aqueous one solution cell proliferation assay	Promega	G3580
Centrifuge	Eppendorf	5424BK745380
Colchicine	Sinopharm Chemical Reagent	61001563
Confocal scanning microscope	Leica	Leica TCS SP8
Coverslip	CITOTEST	80344-1220
DAPI	Beyotime	C1006
DH5α competent cells	Sangon Biotech (Shanghai)	B528413
DL2000 DNA marker	TaKaRa	3427A
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	C11995500BT
Endo-free plasmid mini kit	Omega	D6950
Ezup Column Animal Genomic DNA Purification Kit	Sangon Biotech (Shanghai)	B518251
Fetal bovine serum	Zhejiang Tianhang Biotechnology	11011-8611
Gentian violet	Sinopharm Chemical Reagent	71019944	Dissolve in PBS to prepare 0.1% gentian violet/PBS.
Giemsa staining solution	Sinopharm Chemical Reagent	71020260
GraphPad Prism version 8.0 software	GraphPad	www.graphpad.com	Statistical analysis.
GSK923295	MedChemExpress	HY-10299
HeLa cell line	ATCC	CCL-2
Humidified incubator	Heal Force	HF90/HF240
Image J software	National Institutes of Health	https://imagej.nih.gov/ij/	Image processing and analysis.
Inverted microscope	Nanjing Jiangnan Novel Optics	XD-202
LB agar powder	Sangon Biotech (Shanghai)	A507003
Lipo6000 transfection reagent	Beyotime	C0526
Nikon Ti-S2 microscope	Nikon	Ti-S2
Opti-MEM reduced serum medium	Gibco	31985070
Paraformaldehyde	Sinopharm Chemical Reagent	80096618	Dissolve in PBS to prepare 4% paraformaldehyde/PBS.
Penicillin-streptomycin solution	HyClone	SV30010
SanPrep column DNA gel extraction kit	Sangon Biotech (Shanghai)	B518131
SanPrep column plasmid mini-preps kit	Sangon Biotech (Shanghai)	B518191
T4 DNA ligase	TaKaRa	2011A
T4 polynucleotide kinase	TaKaRa	2021A
TaKaRa Ex Taq	TaKaRa	RR001A
Triton X-100	Sinopharm Chemical Reagent	30188928	Dissolve in PBS to prepare 0.25% Triton X-100/PBS.
Tween 20	Sinopharm Chemical Reagent	30189328	Dissolve in PBS to prepare 0.1% Tween 20/PBS.