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Este artigo relata a construção de células knockout da proteína E associada a centrômeros (CENP-E) usando o sistema CRISPR/Cas9 e três estratégias de triagem baseadas em fenótipos. Utilizamos a linhagem celular knockout do CENP-E para estabelecer uma nova abordagem para validar a especificidade e toxicidade dos inibidores do CENP-E, o que é útil para o desenvolvimento de fármacos e pesquisa biológica.
O sistema CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9 emergiu como uma ferramenta poderosa para edição precisa e eficiente de genes em uma variedade de organismos. A proteína-E associada ao centrômero (CENC-E) é uma cinesina direcionada a mais necessária para a captura de microtúbulos cinetócoros, alinhamento cromossômico e ponto de verificação de montagem do fuso. Embora as funções celulares das proteínas CENP-E tenham sido bem estudadas, tem sido difícil estudar as funções diretas das proteínas CENP-E usando protocolos tradicionais, porque a ablação CENP-E geralmente leva à ativação do ponto de verificação da montagem do fuso, parada do ciclo celular e morte celular. Neste estudo, nós nocauteamos completamente o gene CENP-E em células HeLa humanas e geramos com sucesso as células CENP-E-/- HeLa usando o sistema CRISPR/Cas9.
Três estratégias otimizadas de triagem baseadas em fenótipos foram estabelecidas, incluindo triagem de colônias celulares, fenótipos de alinhamento cromossômico e intensidades fluorescentes das proteínas CENP-E, que efetivamente melhoram a eficiência de triagem e a taxa de sucesso experimental das células knockout do CENP-E . É importante ressaltar que a deleção CENP-E resulta em desalinhamento cromossômico, localização anormal das proteínas serina/treonina quinase B (BubR1) do ponto de verificação mitótico BUB1 e defeitos mitóticos. Além disso, utilizamos o modelo de células HeLa nocaute do CENP-E para desenvolver um método de identificação de inibidores específicos do CENP-E.
Neste estudo, uma abordagem útil para validar a especificidade e toxicidade dos inibidores do CENP-E foi estabelecida. Além disso, este trabalho apresenta os protocolos de edição gênica do CENP-E utilizando o sistema CRISPR/Cas9, que pode ser uma ferramenta poderosa para investigar os mecanismos do CENP-E na divisão celular. Além disso, a linhagem celular knockout do CENP-E contribuiria para a descoberta e validação dos inibidores do CENP-E, que têm implicações importantes para o desenvolvimento de drogas antitumorais, estudos de mecanismos de divisão celular em biologia celular e aplicações clínicas.
A edição do genoma projetado medeia as modificações direcionadas de genes em uma variedade de células e organismos. Em eucariotos, a mutagênese sítio-específica pode ser introduzida pela aplicação de nucleases seqüenciais-específicas que estimulam a recombinação homóloga do DNA-alvo1. Nos últimos anos, várias tecnologias de edição do genoma, incluindo nucleases de dedo de zinco (ZFNs)2,3, nucleases efetoras do tipo ativador de transcrição (TALENs)4,5 e meganucleaseshoming6,7
1. Construção dos vetores knockout do gene CRISPR/Cas9
As células CENP-E-/- HeLa foram geradas com sucesso utilizando o sistema CRISPR/Cas9 (Figura 1). A linha do tempo e as etapas experimentais críticas desse método são mostradas na Figura 1. Primeiro, projetamos e sintetizamos os sgRNAs específicos do CENP-E, recoteamos e ligamos os sgRNAs no plasmídeo pX458, transfectamos o plasmídeo em células HeLa e os cultivamos por 48 h. As células transfectadas foram dissociadas e semead.......
A cinesina-7 CENP-E é um regulador chave no alinhamento cromossômico e no ponto de verificação da montagem do fuso durante a divisão celular 17,19,20. A deleção genética do CENP-E geralmente resulta na ativação do ponto de verificação da montagem do fuso, parada do ciclo celular e morte celular 27,29,51,52.
Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Agradecemos a todos os membros do Laboratório de Citoesqueleto da Fujian Medical University pelas discussões úteis. Agradecemos a Jun-Jin Lin, Zhi-Hong Huang, Ling Lin, Li-Li Pang, Lin-Ying Zhou, Xi Lin e Min-Xia Wu no Centro de Serviços de Tecnologia Pública da Fujian Medical University por sua assistência técnica. Agradecemos a Si-Yi Zheng, Ying Lin e Qi Ke do Centro de Ensino Experimental de Ciências Médicas Básicas da Fujian Medical University por seu apoio. Este estudo foi apoiado pelas seguintes bolsas: Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (número de bolsa 82001608 e 82101678), Fundação de Ciências Naturais da Província de Fujian, China (número de bol....
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
1.5 mL centrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
24-well plate | Corning | 3524 | |
4S Gelred, 10,000x in water | Sangon Biotech (Shanghai) | A616697 | |
50 mL centrifuge tube | Corning | 430828 | |
6 cm Petri dish | Corning | 430166 | |
95% ethanol | Sinopharm Chemical Reagent | 10009164 | |
96-well plate | Corning | 3599 | |
Acetic acid | Sinopharm Chemical Reagent | 10000218 | Dissolve in H2O to prepare a 10% working solution. |
Agarose | Sangon Biotech (Shanghai) | A620014 | |
Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Mouse IgG(H+L) | Beyotime | A0428 | For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution. |
Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) | Beyotime | A0423 | For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution. |
Alexa Fluor 555-labeled Donkey Anti-Mouse IgG(H+L) | Beyotime | A0460 | For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution. |
Anhydrous ethanol | Sinopharm Chemical Reagent | 100092690 | |
Anti-BubR1 rabbit monoclonal antibody | Abcam | ab254326 | For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution |
Anti-CENP-B mouse monoclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-376392 | For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:50 dilution. |
Anti-CENP-E rabbit monoclonal antibody | Abcam | ab133583 | For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution. |
Anti-fade mounting medium | Beyotime | P0131 | Slowing down the quenching of fluorescent signals. |
Anti-α-tubulin mouse monoclonal antibody | Abcam | ab7291 | For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution. |
Biotek Epoch Microplate Spectrophotometer | Biotek Instruments | Biotek Epoch | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sinopharm Chemical Reagent | 69003435 | |
BpiI (BbsI) | Thermo Fisher Scientific | ER1011 | |
CellTiter 96 aqueous one solution cell proliferation assay | Promega | G3580 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5424BK745380 | |
Colchicine | Sinopharm Chemical Reagent | 61001563 | |
Confocal scanning microscope | Leica | Leica TCS SP8 | |
Coverslip | CITOTEST | 80344-1220 | |
DAPI | Beyotime | C1006 | |
DH5α competent cells | Sangon Biotech (Shanghai) | B528413 | |
DL2000 DNA marker | TaKaRa | 3427A | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | C11995500BT | |
Endo-free plasmid mini kit | Omega | D6950 | |
Ezup Column Animal Genomic DNA Purification Kit | Sangon Biotech (Shanghai) | B518251 | |
Fetal bovine serum | Zhejiang Tianhang Biotechnology | 11011-8611 | |
Gentian violet | Sinopharm Chemical Reagent | 71019944 | Dissolve in PBS to prepare 0.1% gentian violet/PBS. |
Giemsa staining solution | Sinopharm Chemical Reagent | 71020260 | |
GraphPad Prism version 8.0 software | GraphPad | www.graphpad.com | Statistical analysis. |
GSK923295 | MedChemExpress | HY-10299 | |
HeLa cell line | ATCC | CCL-2 | |
Humidified incubator | Heal Force | HF90/HF240 | |
Image J software | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/ | Image processing and analysis. |
Inverted microscope | Nanjing Jiangnan Novel Optics | XD-202 | |
LB agar powder | Sangon Biotech (Shanghai) | A507003 | |
Lipo6000 transfection reagent | Beyotime | C0526 | |
Nikon Ti-S2 microscope | Nikon | Ti-S2 | |
Opti-MEM reduced serum medium | Gibco | 31985070 | |
Paraformaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent | 80096618 | Dissolve in PBS to prepare 4% paraformaldehyde/PBS. |
Penicillin-streptomycin solution | HyClone | SV30010 | |
SanPrep column DNA gel extraction kit | Sangon Biotech (Shanghai) | B518131 | |
SanPrep column plasmid mini-preps kit | Sangon Biotech (Shanghai) | B518191 | |
T4 DNA ligase | TaKaRa | 2011A | |
T4 polynucleotide kinase | TaKaRa | 2021A | |
TaKaRa Ex Taq | TaKaRa | RR001A | |
Triton X-100 | Sinopharm Chemical Reagent | 30188928 | Dissolve in PBS to prepare 0.25% Triton X-100/PBS. |
Tween 20 | Sinopharm Chemical Reagent | 30189328 | Dissolve in PBS to prepare 0.1% Tween 20/PBS. |
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