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In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Este artigo relata a construção de células knockout da proteína E associada a centrômeros (CENP-E) usando o sistema CRISPR/Cas9 e três estratégias de triagem baseadas em fenótipos. Utilizamos a linhagem celular knockout do CENP-E para estabelecer uma nova abordagem para validar a especificidade e toxicidade dos inibidores do CENP-E, o que é útil para o desenvolvimento de fármacos e pesquisa biológica.

Abstract

O sistema CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9 emergiu como uma ferramenta poderosa para edição precisa e eficiente de genes em uma variedade de organismos. A proteína-E associada ao centrômero (CENC-E) é uma cinesina direcionada a mais necessária para a captura de microtúbulos cinetócoros, alinhamento cromossômico e ponto de verificação de montagem do fuso. Embora as funções celulares das proteínas CENP-E tenham sido bem estudadas, tem sido difícil estudar as funções diretas das proteínas CENP-E usando protocolos tradicionais, porque a ablação CENP-E geralmente leva à ativação do ponto de verificação da montagem do fuso, parada do ciclo celular e morte celular. Neste estudo, nós nocauteamos completamente o gene CENP-E em células HeLa humanas e geramos com sucesso as células CENP-E-/- HeLa usando o sistema CRISPR/Cas9.

Três estratégias otimizadas de triagem baseadas em fenótipos foram estabelecidas, incluindo triagem de colônias celulares, fenótipos de alinhamento cromossômico e intensidades fluorescentes das proteínas CENP-E, que efetivamente melhoram a eficiência de triagem e a taxa de sucesso experimental das células knockout do CENP-E . É importante ressaltar que a deleção CENP-E resulta em desalinhamento cromossômico, localização anormal das proteínas serina/treonina quinase B (BubR1) do ponto de verificação mitótico BUB1 e defeitos mitóticos. Além disso, utilizamos o modelo de células HeLa nocaute do CENP-E para desenvolver um método de identificação de inibidores específicos do CENP-E.

Neste estudo, uma abordagem útil para validar a especificidade e toxicidade dos inibidores do CENP-E foi estabelecida. Além disso, este trabalho apresenta os protocolos de edição gênica do CENP-E utilizando o sistema CRISPR/Cas9, que pode ser uma ferramenta poderosa para investigar os mecanismos do CENP-E na divisão celular. Além disso, a linhagem celular knockout do CENP-E contribuiria para a descoberta e validação dos inibidores do CENP-E, que têm implicações importantes para o desenvolvimento de drogas antitumorais, estudos de mecanismos de divisão celular em biologia celular e aplicações clínicas.

Introduction

A edição do genoma projetado medeia as modificações direcionadas de genes em uma variedade de células e organismos. Em eucariotos, a mutagênese sítio-específica pode ser introduzida pela aplicação de nucleases seqüenciais-específicas que estimulam a recombinação homóloga do DNA-alvo1. Nos últimos anos, várias tecnologias de edição do genoma, incluindo nucleases de dedo de zinco (ZFNs)2,3, nucleases efetoras do tipo ativador de transcrição (TALENs)4,5 e meganucleaseshoming6,7

Protocol

1. Construção dos vetores knockout do gene CRISPR/Cas9

  1. Selecione a sequência de DNA genômico alvo no gene CENP-E humano (GenBank Accession No. NM_001286734.2) e projetar o sgRNA usando uma ferramenta de projeto CRISPR on-line (http://crispor.tefor.net/).
  2. Insira uma única sequência genômica, selecione o genoma de "Homo sapiens-human-UCSC Dec 2013 (conjunto de análise hg38) + polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs): dbSNP148", e selecione o motivo adjacente.......

Representative Results

As células CENP-E-/- HeLa foram geradas com sucesso utilizando o sistema CRISPR/Cas9 (Figura 1). A linha do tempo e as etapas experimentais críticas desse método são mostradas na Figura 1. Primeiro, projetamos e sintetizamos os sgRNAs específicos do CENP-E, recoteamos e ligamos os sgRNAs no plasmídeo pX458, transfectamos o plasmídeo em células HeLa e os cultivamos por 48 h. As células transfectadas foram dissociadas e semead.......

Discussion

A cinesina-7 CENP-E é um regulador chave no alinhamento cromossômico e no ponto de verificação da montagem do fuso durante a divisão celular 17,19,20. A deleção genética do CENP-E geralmente resulta na ativação do ponto de verificação da montagem do fuso, parada do ciclo celular e morte celular 27,29,51,52.

Acknowledgements

Agradecemos a todos os membros do Laboratório de Citoesqueleto da Fujian Medical University pelas discussões úteis. Agradecemos a Jun-Jin Lin, Zhi-Hong Huang, Ling Lin, Li-Li Pang, Lin-Ying Zhou, Xi Lin e Min-Xia Wu no Centro de Serviços de Tecnologia Pública da Fujian Medical University por sua assistência técnica. Agradecemos a Si-Yi Zheng, Ying Lin e Qi Ke do Centro de Ensino Experimental de Ciências Médicas Básicas da Fujian Medical University por seu apoio. Este estudo foi apoiado pelas seguintes bolsas: Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (número de bolsa 82001608 e 82101678), Fundação de Ciências Naturais da Província de Fujian, China (número de bol....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% Trypsin-EDTAGibco25200056
1.5 mL centrifuge tubeAxygenMCT-150-C
24-well plateCorning3524
4S Gelred, 10,000x in waterSangon Biotech (Shanghai)A616697
50 mL centrifuge tubeCorning430828
6 cm Petri dishCorning430166
95% ethanolSinopharm Chemical Reagent10009164
96-well plateCorning3599
Acetic acidSinopharm Chemical Reagent10000218Dissolve in H2O to prepare a 10% working solution.
AgaroseSangon Biotech (Shanghai)A620014
Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Mouse IgG(H+L)BeyotimeA0428For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)BeyotimeA0423For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Alexa Fluor 555-labeled Donkey Anti-Mouse IgG(H+L)BeyotimeA0460For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Anhydrous ethanolSinopharm Chemical Reagent100092690
Anti-BubR1 rabbit monoclonal antibodyAbcamab254326For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution 
Anti-CENP-B mouse monoclonal antibodySanta Cruz Biotechnologysc-376392For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:50 dilution.
Anti-CENP-E rabbit monoclonal antibodyAbcamab133583For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution.
Anti-fade mounting mediumBeyotimeP0131Slowing down the quenching of fluorescent signals.
Anti-α-tubulin mouse monoclonal antibodyAbcamab7291For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution.
Biotek Epoch Microplate SpectrophotometerBiotek InstrumentsBiotek Epoch
Bovine Serum Albumin (BSA)Sinopharm Chemical Reagent69003435
BpiI (BbsI)Thermo Fisher ScientificER1011
CellTiter 96 aqueous one solution cell proliferation assayPromegaG3580
CentrifugeEppendorf5424BK745380
ColchicineSinopharm Chemical Reagent61001563
Confocal scanning microscopeLeicaLeica TCS SP8
CoverslipCITOTEST80344-1220
DAPIBeyotimeC1006
DH5α competent cellsSangon Biotech (Shanghai)B528413
DL2000 DNA markerTaKaRa3427A
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)GibcoC11995500BT
Endo-free plasmid mini kit figure-materials-4202OmegaD6950
Ezup Column Animal Genomic DNA Purification KitSangon Biotech (Shanghai)B518251
Fetal bovine serumZhejiang Tianhang Biotechnology11011-8611
Gentian violetSinopharm Chemical Reagent71019944Dissolve in PBS to prepare 0.1% gentian violet/PBS.
Giemsa staining solutionSinopharm Chemical Reagent71020260
GraphPad Prism version 8.0 softwareGraphPadwww.graphpad.comStatistical analysis.
GSK923295MedChemExpressHY-10299
HeLa cell lineATCCCCL-2
Humidified incubatorHeal ForceHF90/HF240
Image J softwareNational Institutes of Healthhttps://imagej.nih.gov/ij/Image processing and analysis.
Inverted microscopeNanjing Jiangnan Novel OpticsXD-202
LB agar powderSangon Biotech (Shanghai)A507003
Lipo6000 transfection reagentBeyotimeC0526
Nikon Ti-S2 microscopeNikonTi-S2
Opti-MEM reduced serum mediumGibco31985070
ParaformaldehydeSinopharm Chemical Reagent80096618Dissolve in PBS to prepare 4% paraformaldehyde/PBS.
Penicillin-streptomycin solutionHyCloneSV30010
SanPrep column DNA gel extraction kitSangon Biotech (Shanghai)B518131
SanPrep column plasmid mini-preps kitSangon Biotech (Shanghai)B518191
T4 DNA ligaseTaKaRa2011A
T4 polynucleotide kinaseTaKaRa2021A
TaKaRa Ex TaqTaKaRaRR001A
Triton X-100Sinopharm Chemical Reagent30188928Dissolve in PBS to prepare 0.25% Triton X-100/PBS.
Tween 20Sinopharm Chemical Reagent30189328Dissolve in PBS to prepare 0.1% Tween 20/PBS.

References

  1. Jiang, W., Bikard, D., Cox, D., Zhang, F., Marraffini, L. A. RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature Biotechnology. 31 (3), 233-239 (2013).
  2. Bibikova, M., Beumer, K., Trautman, J. K., Carroll, D.

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