Se describe un método de microplaca basado en densidad óptica para cuantificar el crecimiento bacteriano a largo plazo en presencia de bacteriófagos, adecuados para actinomicetos y otras bacterias de crecimiento lento. Este método incluye modificaciones para reducir la evaporación y la condensación de la tapa y código R para calcular las métricas de infección por virus, incluido el área bajo la curva, el máximo de crecimiento y la virulencia relativa.
Los bacteriófagos son una parte clave de los entornos naturales, y tienen una poderosa capacidad para dar forma a las poblaciones bacterianas. Para comprender cómo los fagos individuales interactúan con huéspedes bacterianos de crecimiento lento, como los actinomicetos, se necesita un método fácil y confiable para cuantificar el crecimiento bacteriano a largo plazo en presencia de fagos. Los lectores espectrofotométricos de microplacas permiten mediciones repetidas de alto rendimiento, pero incubar un volumen pequeño durante un tiempo prolongado puede presentar desafíos técnicos. Este procedimiento adapta una microplaca estándar de 96 pocillos para permitir el cocultivo de fagos y bacterias sin submuestreo durante 96 h, con el crecimiento bacteriano registrado cada 8 h utilizando valores de absorbancia espectrofotométrica. Estos valores de densidad óptica se analizan utilizando R para obtener métricas de infección, incluido el porcentaje de inhibición del crecimiento, la virulencia relativa y el índice de Stacy-Ceballos. Los métodos descritos aquí proporcionan una forma efectiva de realizar y analizar experimentos de curva de crecimiento de microplacas de duración prolongada e incluyen modificaciones para reducir la evaporación y la condensación de la tapa. Estos protocolos facilitan los ensayos basados en microplacas de las interacciones entre los huéspedes bacterianos de crecimiento lento y sus bacteriófagos.
Los bacteriófagos o fagos son virus que infectan bacterias. Son las entidades biológicas más numerosas del planeta1, y generalmente se acepta que los bacteriófagos influyen en la evolución bacteriana y en los procesos ecosistémicos 2,3,4. Existen varios métodos para describir, medir y analizar el rango de huéspedes bacteriófagos 8 y la dinámica de infección5,6, incluidos los métodos basados en agar comoel método 7 de agar de doble capa y los métodos de microplacas basados en densidad óptica 8,9,10,11,12. Cada método tiene sus propias ventajas y desventajas. Debido a su eficiencia, las pruebas de recubrimiento que utilizan el método de agar de doble capa son el "estándar de oro" para los ensayos de rango de huésped, pero este método requiere mucho tiempo y mano de obra9. Los métodos rápidos de microplacas, que devuelven resultados en 24 h o menos, dan excelentes resultados para huéspedes bacterianos de crecimiento rápido como Escherichia coli 9,10,11,12, pero son demasiado breves para mostrar la progresión de la infección por bacteriófagos en huéspedes bacterianos de crecimiento más lento como actinomicetos7,13,14,15.
Un ensayo de microplacas basado en densidad óptica diseñado para bacterias de crecimiento rápido no se puede ejecutar durante los múltiples días necesarios para caracterizar la dinámica de la infección en una bacteria huésped de crecimiento lento sin que se produzca evaporación y dando densidades bacterianas artificialmente altas. Por lo tanto, la obtención de datos comparables de alto rendimiento sobre la dinámica de la infección por bacteriófagos para especies bacterianas de crecimiento lento requiere técnicas especializadas adaptadas para estas bacterias.
El método de microplaca presentado aquí reduce la evaporación, lo que permite que las bacterias de crecimiento lento se cocultiven con un fago durante un período prolongado de 96 h y permite investigaciones sobre la dinámica de la infección por fagos y el rango de huéspedes. Este método también muestra el índice16 de Stacy-Caltos, una métrica basada en la densidad óptica que permite comparaciones de virulencia entre sistemas de virus huésped dispares.
Si bien este protocolo está escrito para Gordonia terrae, también se ha utilizado con éxito para Gordonia lacunae, Gordonia rubripertincta y Gordonia westfalica.
1. Preparación de bacterias
2. Preparación de fagos
NOTA: Los resultados representativos reportados se obtuvieron con el fago de Gordonia DelRio21, un bacteriófago templado aislado en G. terrae. Estos métodos también se han utilizado con éxito con otros fagos de Gordonia .
3. Preparación de microplacas
NOTA: Para este método se deben utilizar microplacas de fondo plano de 96 pocillos (consulte la Tabla de materiales). Toda la preparación y carga de la placa debe completarse en un gabinete de bioseguridad, y se deben utilizar buenas prácticas microbiológicas17.
4. Cargar la placa con bacterias y fagos
NOTA: Toda la preparación y carga de la placa debe completarse en un gabinete de bioseguridad, y se deben usar buenas prácticas microbiológicas17 .
5. Incubación y medición de absorbancia
6. Análisis de datos
Un experimento tiene éxito si la curva de crecimiento resultante muestra un aumento en la población bacteriana de control positivo a lo largo del tiempo sin fluctuación repentina en la absorbancia. Ejemplos de un experimento exitoso en un MOI de 1 con y sin una infección productiva por fagos se muestran en la Figura 2 y la Figura 3, respectivamente. Una infección productiva a un MOI de 0,01 se representa en la Figura 4. El patrón de crecimiento de control positivo (curva verde) visto en las tres figuras indica que las bacterias están creciendo, no se están aglutinando durante el crecimiento y no hay contaminantes presentes. La aglutinación y la contaminación se indican mediante una absorbancia inusualmente alta en un solo punto de tiempo. Las desviaciones estándar suelen aumentar a lo largo del tiempo de un experimento; Sin embargo, un aumento drástico o desviaciones estándar superpuestas entre las curvas de control e infectadas pueden indicar contaminación o aglutinación en uno o más pozos.
La curva de crecimiento que representa una infección productiva por fagos, representada por la Figura 2, muestra una absorción bacteriana reducida a lo largo del tiempo en pozos con el fago agregado. Esta reducción en la densidad bacteriana no se verá si la bacteria está fuera del rango de huéspedes del fago, como se muestra en la Figura 3.
Las métricas de infección se muestran para todos los experimentos representativos, con un I SC relativamente grande para las infecciones productivas en la Figura 2 y la Figura 4 y un ISC muy pequeño en la Figura 3 para el fago que no infectó eficientemente a la bacteria huésped.
Figura 1: Diseño de microplacas. Las áreas grises están llenas de 0.1% de agarosa. Los pocillos en blanco en la columna 3 y la columna 4 son pocillos de control positivos sin fagos que contienen solo tampón de fagos y 2.0 x 106 ufc/ml bacterias. Los pocillos punteados contienen fagos y bacterias 2.0 x 106 ufc/ml; los puntos grandes en la columna 5 y la columna 6 indican un MOI de 1 con 2.0 x 106 ufp/ml de fago; los puntos medios de la columna 7 y la columna 8 indican un MOI de 0,1 con 2,0 x 105 ufp/ml de fago; y los pequeños puntos en la columna 9 y la columna 10 indican un MOI de 0.01 con 2.0 x 104 ufp/mL de fago. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Un experimento exitoso de la curva de crecimiento con un fago en un MOI de 1 que infecta productivamente a la bacteria huésped. Los valores medios de absorbancia (± desviación estándar) se muestran para bacterias no infectadas (verde) y bacterias con el fago añadido (azul). Abreviaturas: AUC = área bajo la curva; PI AUC = porcentaje de inhibición del crecimiento calculado a partir del área bajo la curva; Nasíntota = valor máximo de crecimiento; PImax = porcentaje de inhibición del crecimiento calculado a partir de los valores de crecimiento máximo; ISC = Índice de Stacy-Ceballos. Este gráfico representa el fago templado de Gordonia DelRio infectando a G. terrae, la bacteria en la que fue aislada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Un experimento exitoso de la curva de crecimiento con un fago en un MOI de 1 que no infecta eficientemente a la bacteria huésped. Los valores medios de absorbancia (± desviación estándar) se muestran para bacterias no infectadas (verde) y bacterias con el fago añadido (azul). Abreviaturas: AUC = área bajo la curva; PI AUC = porcentaje de inhibición del crecimiento calculado a partir del área bajo la curva; Nasíntota = valor máximo de crecimiento; PImax = porcentaje de inhibición del crecimiento calculado a partir de los valores de crecimiento máximo; ISC = Índice de Stacy-Ceballos. Este gráfico representa la infección por G. rubripertincta por DelRio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Un experimento exitoso de la curva de crecimiento con un fago en un MOI de 0.01. Los valores medios de absorbancia (± desviación estándar) se muestran para bacterias no infectadas (verde) y bacterias con el fago añadido (azul). Abreviaturas: AUC = área bajo la curva; PI AUC = porcentaje de inhibición del crecimiento calculado a partir del área bajo la curva; Nasíntota = valor máximo de crecimiento; PImax = porcentaje de inhibición del crecimiento calculado a partir de los valores de crecimiento máximo; ISC = Índice de Stacy-Ceballos. Este gráfico representa la infección por G. terrae por DelRio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Este método de microplaca basado en densidad óptica permite investigar el rango de huéspedes de bacteriófagos y la dinámica de infección11 y muestra la utilidad del índice16 de Stacy-Ceballos como medida de la virulencia de los bacteriófagos. Si bien este método podría utilizarse con cualquier sistema bacteriófago-huésped, fue diseñado específicamente para adaptar ensayos rápidos de crecimiento de microplacas 9,10,11 para su uso con bacterias de crecimiento más lento como los actinomicetos. Los ensayos rápidos de microplacas no se pueden usar para bacterias de crecimiento lento sin modificaciones para abordar la evaporación y la condensación de la tapa. Este método describe estas modificaciones necesarias y demuestra, por primera vez, el uso del índice de Stacy-Ceballos y métricas relacionadas16 para describir la infección por bacteriófagos.
La evaporación puede ser un desafío sustancial en ensayos de curva de crecimiento en placa de 96 pocillos de varios días; Este método resuelve ese problema agregando agarosa a los pozos fronterizos y los espacios entre los pozos. El margen de agarosa, combinado con el tratamiento antivaho de la tapa22, proporciona la humedad necesaria dentro de la microplaca y permite mediciones fiables de densidad óptica. Sin la humedad añadida, se produce una evaporación sustancial del efecto borde23 durante el largo período de incubación requerido, lo que lleva a lecturas de densidad óptica artificialmente altas. El tratamiento antivaho de la tapa es una modificación necesaria porque la condensación de la tapa también puede elevar artificialmente los valores de densidad óptica. Agitar las placas durante el período de incubación es una modificación recomendada, ya que las bacterias actinomicetos pueden agruparse durante el crecimiento, dando valores de densidad óptica artificialmente altos y disminuyendo efectivamente la multiplicidad de la infección.
La proporción de bacterias a fagos en experimentos que caracterizan la dinámica de la infección es crítica, ya que debe haber suficientes fagos para mostrar un efecto de infección, pero no tantos como para que la población bacteriana huésped se estrelle inmediatamente9 o la frecuencia de lisogenia aumente dramáticamente28. En este método, la razón que resultó ser más efectiva para obtener resultados consistentes fue un MOI de 1, pero también se obtuvieron resultados utilizables con MOI de 0.1 y 0.01. Al implementar este método, se recomienda elegir una concentración de bacterias y probar múltiples concentraciones de fagos en el rango MOI de 0.01-1 9,10,11.
Esta técnica descrita aquí permite evaluar las interacciones bacteriófago-huésped para detectar bacterias de crecimiento lento en ensayos de microplacas de alto rendimiento en lugar de con submuestreo de un matraz de cultivo más grande en cada intervalo de medición29. Además, al demostrar cómo se pueden adaptar los ensayos de crecimiento de microplacas 9,10,11, esta técnica aumenta la utilidad de otros ensayos de bacteriófagos basados en microplacas para bacterias de crecimiento más lento, incluida la caracterización de fagos 5,6,12 y estudios de evolución 30,31. Finalmente, este método demuestra el uso del índice de Stacy-Ceballos16 para describir la infección por bacteriófagos. Esta métrica se desarrolló inicialmente con datos de un sistema modelo de virus arqueal y se calcula a partir de valores de densidad óptica, lo que le da una utilidad generalizada en sistemas de virus dispares.
Los autores no tienen nada que revelar.
Este trabajo fue apoyado por una subvención del Instituto de Integración de Biología (BII) de NSF DBI (premio no. 2119968; PI-Ceballos) y por el programa Arkansas INBRE, con una beca del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales, (NIGMS), P20 GM103429 de los Institutos Nacionales de Salud. Los autores también aprecian el apoyo del Programa de Investigación de Pregrado de Verano Patterson en la Universidad Bautista de Ouachita.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Agarose | Omni-Pur | 2090 | for filling border wells of microplate |
Costar 96 Well Lid Low Evaporation Corner Notch | Corning | 3931 | replacement microplate lid |
Isopropanol | Fisher Chemical | A461-4 | for lid coating |
Microplate reader | Tecan Spark 20M | ||
Microplate Shaker with 4-Place Platform | Thermo Fisher Scientific | 88-861-023 | to shake plates during incubation |
Non-Tissue Culture-Treated Plate 96 well | Falcon (a Corning Brand) | 351172 | microplate for growth curve assay |
Peptone yeast calcium (PYCa) agar | Homemade | 1 g peptone 15 g yeast extract 15 g agar 990 mL dd H2O 4.5 mL 1 M CaCl2 2.5 mL 40% dextrose 1 mL 10 mg/mL cycloheximide | |
Peptone yeast calcium (PYCa) broth | Homemade, from Reference 16 | 1 g peptone 15 g yeast extract 990 mL dd H2O 4.5 ml 1 M CaCl2 2.5 mL 40% dextrose 1 mL 10 mg/mL cycloheximide | |
Peptone yeast calcium (PYCa) top agar | Homemade | 1 g peptone 15 g yeast extract 4 g agar 990 mL dd H2O 4.5 mL 1M CaCl2 2.5 mL 40% dextrose | |
Petri plates | Thermo Fisher Scientific | FB0875713 | for determination of bacterial concentration and phage titer assay |
Phage Buffer | Homemade, from Reference 7 | 10 mL 1 M Tris, pH 7.5 10 mL 1 M MgSO4 4 g NaCl 980 ml dd H2O | |
R software | https://www.r-project.org/ | version 4.3.0 | |
Sterile Disposable PETG Flask Baffled Bottom w/Vented Closure | Thermo Fisher Scientific | 4116-1000 | for bacterial culture |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | 9036-19-5 | for lid coating |
Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este JoVE artículos
Solicitar permisoExplorar más artículos
This article has been published
Video Coming Soon
ACERCA DE JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados