Sistema Modelo Intestinal Tridimensional Básico (3D) com um Componente Imunológico

Summary

Aqui descrevemos a construção de um sistema básico de linhagem celular intestinal tridimensional (3D) e um protocolo de inclusão em parafina para avaliação microscópica de luz de equivalentes intestinais fixos. A coloração de proteínas selecionadas permite a análise de múltiplos parâmetros visuais de um único experimento para uso potencial em estudos pré-clínicos de triagem de drogas.

Abstract

Tem havido um aumento no uso de modelos intestinais in vivo e in vitro para estudar a fisiopatologia de doenças inflamatórias intestinais, para a triagem farmacológica de substâncias potencialmente benéficas e para estudos de toxicidade de componentes alimentares potencialmente nocivos. De relevância, existe uma demanda atual para o desenvolvimento de modelos in vitro baseados em células para substituir modelos animais. Aqui, um protocolo para um modelo básico de equivalente intestinal tridimensional (3D) de "tecido saudável" usando linhagens celulares é apresentado com o duplo benefício de fornecer simplicidade experimental (sistema padronizado e facilmente repetível) e complexidade fisiológica (enterócitos Caco-2 com um componente imune de suporte de monócitos U937 e fibroblastos L929). O protocolo também inclui a inclusão em parafina para avaliação microscópica de luz de equivalentes intestinais fixos, proporcionando assim a vantagem de analisar múltiplos parâmetros visuais de um único experimento. Cortes corados pela hematoxilina e eosina (H&E) mostrando as células colunares do Caco-2 formando uma monocamada apertada e regular nos tratamentos controle são usados para verificar a eficácia do modelo como sistema experimental. Usando glúten como um componente alimentar pró-inflamatório, os parâmetros analisados a partir de cortes incluem espessura reduzida da monocamada, bem como ruptura e desprendimento da matriz subjacente (H&E), diminuição da expressão de proteínas de junção apertada como mostrado a partir da coloração de ocludina (quantificável estatisticamente) e ativação imunológica de células U937 migratórias, como evidenciado a partir da coloração de cluster de diferenciação 14 (CD14) e diferenciação relacionada a CD11b em macrófagos. Como demonstrado pelo uso de lipopolissacarídeo para simular a inflamação intestinal, parâmetros adicionais que podem ser medidos são o aumento da coloração de muco e a expressão de citocinas (como midkine) que podem ser extraídas do meio antes da fixação. O modelo básico tridimensional (3D) da mucosa intestinal e cortes fixos podem ser recomendados para estudos do estado inflamatório e integridade da barreira, com a possibilidade de analisar múltiplos parâmetros visuais quantificáveis.

Introduction

A barreira epitelial intestinal, um revestimento interno de uma célula de espessura contendo diferentes tipos de células epiteliais, constitui a primeira barreira ou interface física defensiva entre o meio externo e o meio interno do corpo ^1,2. Os enterócitos do tipo colunar constituem o tipo mais abundante de células epiteliais. Estes são responsáveis pela manutenção da integridade da barreira epitelial por meio de interações entre vários componentes da barreira, incluindo as tight junctions (TJs), desempenhando um papel significativo no aperto da barreira ^1,3

Protocol

1. Preparação do modelo básico de mucosa intestinal reconstruída em 3D

OBS: Todo o procedimento deve ser realizado em capela de fluxo laminar estéril. Todas as etapas do procedimento que envolvem o uso da incubadora de células significam que as culturas são incubadas a 37 °C em uma atmosfera umidificada contendo 5% de CO₂ (salvo indicação em contrário no _protocolo).

1. Preparo prévio das linhagens celulares utilizadas no sistema modelo intestinal

Discussion

O sistema modelo básico de mucosa intestinal reconstruída aqui apresentado (Figura 6) combina complexidade fisiológica (culturas de células 3D mais relevantes fisiologicamente contendo uma monocamada de Caco-2 com um suporte de lâmina própria rico em MEC contendo fibroblastos e monócitos) com simplicidade experimental (usando linhagens celulares humanas comerciais para produzir um sistema padronizado e facilmente repetível)¹³. Como tal, este sistema modelo é .......