רספירומטריה ברזולוציה גבוהה להערכת תפקוד המיטוכונדריה בזרעונים אנושיים

Summary

ניתוח תפקוד המיטוכונדריה של הזרע על ידי ספירומטריה ברזולוציה גבוהה מאפשר למדוד את צריכת החמצן של זרעונים הנעים בחופשיות במערכת תא סגור. ניתן ליישם את הטכניקה למדידת נשימה בזרעונים אנושיים, המספקת מידע על מאפייני המיטוכונדריה של הזרע ושלמותו.

Abstract

איכות הזרע נלמדת לעתים קרובות על ידי ניתוח זרע שגרתי, שהוא תיאורי ולעתים קרובות לא חד משמעי. אי פוריות הגבר קשורה לשינוי בפעילות המיטוכונדריה של הזרע, ולכן מדידת תפקוד המיטוכונדריה של הזרע היא אינדיקטור לאיכות הזרע. רספירומטריה ברזולוציה גבוהה היא שיטה למדידת צריכת החמצן של תאים או רקמות במערכת תא סגור. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת כדי למדוד נשימה בזרע אנושי ומספקת מידע על האיכות והשלמות של מיטוכונדריית הזרע. ספירומטריה ברזולוציה גבוהה מאפשרת לתאים לנוע בחופשיות, וזה יתרון מראש במקרה של זרע. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת עם זרעונים שלמים או חדירים, ומאפשרת ללמוד את תפקוד המיטוכונדריה של זרע שלם ואת הפעילות של מתחמי שרשרת נשימה בודדים. מכשיר האוקסיגרף ברזולוציה גבוהה משתמש בחיישנים כדי למדוד את ריכוז החמצן יחד עם תוכנה רגישה כדי לחשב את צריכת החמצן. הנתונים משמשים לחישוב מדדי נשימה המבוססים על יחסי צריכת החמצן. כתוצאה מכך, המדדים הם הפרופורציות של שני שיעורי צריכת חמצן והם מנורמלים פנימית למספר התא או מסת החלבון. מדדי הנשימה הם אינדיקטור לתפקוד מיטוכונדריאלי זרע ולתפקוד לקוי.

Introduction

על פי הערכות, אי פוריות הגבר מהווה 40%-50% מכלל מקרי אי הפוריות בזוגות¹. ניתוח זרע קונבנציונלי ממלא תפקיד מכריע בקביעת פוריות הגבר; עם זאת, לכ -15% מהגברים העקרים יש פרמטרים זרע תקינים². בנוסף, ניתוח זרע שגרתי מספק מידע מוגבל על תפקוד הזרע ואינו משקף פגמים עדינים^{בזרע 3}.

למיטוכונדריה של זרע יש מבנה מיוחד, מכיוון שהם מסודרים כנדן סלילי סביב השוטון. מעטפת המיטוכונדריה מכילה מספר משתנה של מיטוכונדריה המחוברים על ידי מקשרים אינטרמיטוכונדריאליים ומעוגנים לשלד הציטוכונדריאלי על ידי סידורי חלבון מסודרים על קרום המיטוכונדריה^{החיצוני 4,5}

Protocol

הניסויים אושרו על ידי ועדת האתיקה של Facultad de Medicina de la Universidad de la República, מונטווידאו, אורוגוואי.

איור 1: זרימת עבודה עבור רספירומטריה ברזולוציה גבוהה להערכת תפקוד המיטוכונדריה בזרע אנושי ?.......

Discussion

HRR תלוי באופן קריטי במספר שלבים: (א) תחזוקת הציוד, (ב) כיול מדויק של חיישני החמצן, (ג) טיטרציית uncoupler²⁶, ולבסוף, (ד) שימוש נאות במדדים המייצגים את תפקוד המיטוכונדריה. תחזוקת הציוד היא קריטית. מומלץ להחליף את קרומי חיישן החמצן הפולרוגרפי באופן קבוע ולתקן את הרקע האינסטרומנטלי. שטיפה ?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acid free- Bovine serum albumine	Sigma Aldrich	A8806
Adenosine 5'-diphosphate monopotassium salt dihydrate	Sigma Aldrich	A5285
Animycin A from streptomyces sp.	Sigma Aldrich	A8674
Calcium chloride	Sigma Aldrich	C4901
carbonyl cyanide-P- trifluoromethoxy-phenylhydrazone	Sigma Aldrich	C2920
DatLab sofware version 4,2	Oroboros Instruments GmbH	N/A
D-glucose	Sigma Aldrich	G7021
Digitonin	Sigma Aldrich	D141
EGTA	Sigma Aldrich	E4378
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
L glutamic acid	Sigma Aldrich	G1251
L malic acid	Sigma Aldrich	M1000
Magnesium sulphate	Sigma Aldrich	M7506
Microliter Syringes	Hamilton	87900 or 80400
Microscope camera	Basler	acA780-75gc
Microscope Eclipse E200 with phase contrast 10X Ph+	Nikon	N/A
Monopotassium phosphate	Sigma Aldrich	P5655
MOPS	Sigma Aldrich	M1254
Oligomycin A	Sigma Aldrich	75351
Oxygraph-2 K	Oroboros Instruments GmbH	N/A
Potassium chloride	Sigma Aldrich	P3911
Power O2k-Respirometer	Oroboros Intruments	10033-01
Rotenone	Sigma Aldrich	R8875
Saccharose	Sigma Aldrich	S0389
Sodium bicarbonate	Sigma Aldrich	S5761
Sodium lactate	Sigma Aldrich	L7022
Sodium pyruvate	Sigma Aldrich	P2256
Sperm class analyzer 6.3.0.59 Evolution-SCA Research	Microptic	N/A
Sperm Counting Chamber DRM-600	Millennium Sciences CELL-VU	N/A
Succinate disodium salt	Sigma Aldrich	W327700