Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Анализ митохондриальной функции сперматозоидов с помощью респирометрии высокого разрешения позволяет измерять потребление кислорода свободно движущимися сперматозоидами в замкнутой камере. Метод может быть применен для измерения дыхания в сперматозоидах человека, что дает информацию о митохондриальных характеристиках и целостности сперматозоидов.

Abstract

Качество спермы часто изучается с помощью рутинного анализа спермы, который является описательным и часто неубедительным. Мужское бесплодие связано с измененной митохондриальной активностью сперматозоидов, поэтому измерение митохондриальной функции сперматозоидов является показателем качества спермы. Респирометрия высокого разрешения — это метод измерения потребления кислорода клетками или тканями в системе с закрытой камерой. Этот метод может быть применен для измерения дыхания в сперматозоидах человека и предоставляет информацию о качестве и целостности митохондрий сперматозоидов. Респирометрия с высоким разрешением позволяет клеткам свободно двигаться, что является априорным преимуществом в случае сперматозоидов. Этот метод может применяться с интактными или пермеабилизированными сперматозоидами и позволяет исследовать интактную функцию митохондрий сперматозоидов и активность отдельных комплексов дыхательной цепи. Оксиграф высокого разрешения использует датчики для измерения концентрации кислорода в сочетании с чувствительным программным обеспечением для расчета потребления кислорода. Полученные данные используются для расчета дыхательных индексов на основе коэффициентов потребления кислорода. Следовательно, индексы представляют собой пропорции двух скоростей потребления кислорода и внутренне нормируются к количеству клеток или массе белка. Дыхательные индексы являются индикатором митохондриальной функции и дисфункции сперматозоидов.

Introduction

По оценкам, мужское бесплодие составляет 40-50% всех случаев бесплодия в парах1. Обычный анализ спермы играет решающую роль в определении мужской фертильности; Тем не менее, примерно 15% бесплодных мужчин имеют нормальные параметры сперматозоидов2. Кроме того, рутинный анализ спермы дает ограниченную информацию о функции сперматозоидов и не отражает малозаметные дефекты сперматозоидов3.

Митохондрии сперматозоидов имеют особое строение, так как расположены в виде спиральной оболочки вокруг жгутиков. Митохондриальная оболочка содержит переменное число митохондрий, соедине....

Protocol

Эксперименты были одобрены Комитетом по этике Медицинского факультета Университета Республики в Монтевидео, Уругвай.

figure-protocol-213
Рисунок 1: Рабочий процесс для респирометрии высокого разреше.......

Representative Results

Определение оптимальной концентрации дигитонина в сперматозоидах
В этом протоколе мы представляем использование HRR для мониторинга изменений OXPHOS в сперматозоидах человека в режиме реального времени. Поскольку метод может быть использован для анализа интактных или дигито?.......

Discussion

HRR критически зависит от нескольких этапов: (а) техническое обслуживание оборудования, (б) точная калибровка датчиков кислорода, (в) титрование развязки26 и, наконец, (г) адекватное использование индексов, представляющих митохондриальную функцию. Техническое обслуживание об?.......

Acknowledgements

Мы хотели бы поблагодарить андрологическую клинику Fertilab, особенно Хосе Марию Монтеса и Андреа Торрентса, за то, что они предоставили нам доступ к донорам. Финансирование: A.C. поддерживается грантами Universidad de la República (CSIC_2018, Espacio Interdisciplinario_2021). Дополнительное финансирование было получено от Programa de Desarrollo de Ciencias Básicas (PEDECIBA, Уругвай). P.I. и R.S. поддерживаются Universidad de la República (I+D, CSIC 2014; I+D, CSIC 2016, Iniciación a la Investigación, CSIC 2019 и FMV_1_2017_1_136490 ANII-Уругвай). P.I. поддерживается POS_FMV_2018_1_1007814 и CAP-UDELAR 2020. Рисунки проиллюстрированы с помощью Biorender.com.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Acid free- Bovine serum albumineSigma AldrichA8806
Adenosine 5'-diphosphate monopotassium salt dihydrateSigma AldrichA5285
Animycin A from streptomyces sp.Sigma AldrichA8674
Calcium chlorideSigma AldrichC4901
carbonyl cyanide-P- trifluoromethoxy-phenylhydrazoneSigma AldrichC2920
DatLab sofware version 4,2Oroboros Instruments GmbHN/A
D-glucoseSigma AldrichG7021
DigitoninSigma AldrichD141
EGTASigma AldrichE4378
HEPESSigma AldrichH3375
L glutamic acidSigma AldrichG1251
L malic acidSigma AldrichM1000
Magnesium sulphateSigma AldrichM7506
Microliter SyringesHamilton87900 or 80400
Microscope cameraBasleracA780-75gc
Microscope Eclipse E200 with phase contrast 10X Ph+NikonN/A
Monopotassium phosphateSigma AldrichP5655
MOPSSigma AldrichM1254
Oligomycin ASigma Aldrich75351
Oxygraph-2 KOroboros Instruments GmbHN/A
Potassium chlorideSigma AldrichP3911
Power O2k-RespirometerOroboros Intruments10033-01
RotenoneSigma AldrichR8875
SaccharoseSigma AldrichS0389
Sodium bicarbonateSigma AldrichS5761
Sodium lactateSigma AldrichL7022
Sodium pyruvateSigma AldrichP2256
Sperm class analyzer 6.3.0.59 Evolution-SCA ResearchMicropticN/A
Sperm Counting Chamber DRM-600Millennium Sciences CELL-VUN/A
Succinate disodium saltSigma AldrichW327700

References

  1. Agarwal, A., Mulgund, A., Hamada, A., Chyatte, M. R. A unique view on male infertility around the globe. Reproductive Biology and Endocrinology. 13, 37 (2015).
  2. Guzick, D. S., et al. Sperm morphology, motility, and concentration....

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved