שמירה על שלמות גנום הביצית נחוצה כדי להבטיח את הנאמנות הגנטית בעובר המתקבל. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מדויק לאיתור שברים דו-גדיליים בדנ"א בתאי נבט נקביים של יונקים.
הביציות הן בין התאים הגדולים ומאריכי החיים ביותר בגוף הנשי. הם נוצרים בשחלות במהלך ההתפתחות העוברית ונשארים נעצרים בשלב של מיוזה I. המצב השקט עשוי להימשך שנים עד שהביציות מקבלות גירוי לגדול ולקבל את היכולת לחדש את המיוזה. מצב מעצר ממושך זה הופך אותם לרגישים ביותר לצבירת עלבונות מזיקים לדנ"א, המשפיעים על השלמות הגנטית של הגמטות הנקביות, ולכן, על שלמותו הגנטית של העובר העתידי.
לפיכך, יש חשיבות מכרעת לפיתוח שיטה מדויקת לאיתור נזק לדנ"א, שהיא הצעד הראשון להקמת מנגנוני תגובה לנזקי דנ"א. מאמר זה מתאר פרוטוקול נפוץ לבדיקת נוכחות והתקדמות של נזק לדנ"א בביציות שנעצרו בשלב במהלך תקופה של 20 שעות. באופן ספציפי, אנו מנתחים שחלות עכברים, שולפים את קומפלקסי קומולוס-ביציות (COC), מסירים את תאי הקומולוס מה-COC, ומתרבתים את הביציות בתווך Μ2 המכיל 3-איזובוטיל-1-מתיל-קסנטין כדי לשמור על מצב המעצר. לאחר מכן, הביציות מטופלות בתרופה ציטוטוקסית, אנטי-ניאופלזמה, אטופוסיד, כדי לגרום לשברים דו-גדיליים (DSB).
על ידי שימוש באימונופלואורסנציה ובמיקרוסקופ קונפוקלי, אנו מזהים ומכמתים את רמות חלבון הליבה γH2AX, שהוא הצורה הזרחנית של ההיסטון H2AX. H2AX הופך לפוספורילציה באתרים של DSB לאחר נזק לדנ"א. חוסר היכולת לשחזר את שלמות הדנ"א בעקבות נזק לדנ"א בביציות עלול להוביל לאי פוריות, למומים מולדים ולשיעורים מוגברים של הפלות ספונטניות. לכן, הבנת מנגנוני התגובה לנזק לדנ"א, ובה בעת ביסוס שיטה שלמה לחקר מנגנונים אלה, חיוניים לחקר הביולוגיה של הרבייה.
תהליך המיוזה בתאי נבט נקביים של יונקים מתחיל בשחלות לפני הלידה. המספר הכולל של הביציות נקבע בשחלות בעיקר במהלך embryogenesis. הביציות נכנסות למיוזה ונשארות עצורות בשלב I1. לאחר תחילת ההתבגרות המינית והייצור והפעולה האנדוקרינית של הורמון מגרה זקיק (FSH) והורמון luteinizing (LH), הביציות עשויות ליזום מחדש ולהשלים מיוזה2. אצל בני אדם, מעצר שלב יכול להימשך עד 50 שנה3. חלוקות התאים לאחר הכניסה למיוזה I אינן סימטריות, וכתוצאה מכך נוצר גוף קוטבי קטן וביצית השומרת על גודלה. לכן, רוב המרכיבים cytoplasmic מאוחסנים ooplasm במהלך embryogenesis מוקדם4. לאחר מכן, הביציות נכנסות למיוזה II, מבלי לשנות מחדש את הגרעין שלהן או לפרק את הכרומוזומים שלהן, ונשארות כלואות במטא-פאזה II עד להפריה5.
מאפיין ייחודי המבדיל בין ביציות לתאים סומטיים הוא מצב המעצר בשלב I, כאשר לביצית יש גרעין שלם (מעצר שלפוחית נבט [GV]), המכונה שלבGV 6. בהתבסס על ארגון הכרומטין, הביציות בשלב GV מסווגות לשתי קטגוריות: גרעין לא מוקף (NSN) וגרעין מוקף (SN)7,8. בביציות בשלב ה-GV של NSN, הכרומטין מתפשט בכל האזור הגרעיני, והשעתוק פעיל, ואילו בביציות SN, הכרומטין יוצר טבעת קומפקטית המקיפה את הגרעין, והשעתוק שקט9. שני סוגי הביציות בשלב GV מראים יכולת מיוטית; הן נכנסות למיוזה באותו קצב, אך הביציות של NSN מציגות יכולת התפתחותית נמוכה ואינן יכולות להתפתח מעבר לעובר בן שני התאים10.
המצב הממושך של מעצר שלב I מעלה את שכיחות הצטברות הנזק לדנ"א11. לכן, מנגנוני התגובה לנזק לדנ"א בביציות חיוניים כדי לאפשר ייצור של גמטות בעלות שלמות גנטית ולהבטיח שלעובר שנוצר יש תוכן כרומוזומלי פיזיולוגי.
היבט מרכזי של תגובת הנזק לדנ"א הוא תיקון דנ"א. המסלולים העיקריים לתיקון DSB בתאים אאוקריוטים כוללים הצטרפות קצה לא הומולוגית (NHEJ), רקומבינציה הומולוגית (HR) וחלופה NHEJ 12,13,14,15. NHEJ הוא מנגנון מהיר יותר אך נוטה יותר לשגיאות, בעוד HR דורש יותר זמן כדי להשלים אבל יש נאמנות גבוהה16.
אין מספיק ידע על המנגנונים שבהם הביציות משתמשות לתיקון נזקי דנ"א. מחקרים הראו כי נזק לדנ"א הנגרם בביציות יונקים בוגרות לחלוטין על ידי שימוש בחומרים גנוטוקסיים, כגון אטופוסיד, דוקסורוביצין או UVB או קרינה מייננת, אינו משפיע על העיתוי וקצב היציאה משלב I מעצר17. ביציות יכולות לעבור פירוק GV (GVBD) גם בנוכחות רמות גבוהות של נזק. נזק זה יכול להיקבע על ידי תצפית של γH2AX. צורה זרחנית זו של H2AX (γΗ2ΑΧ) היא סמן DSB, הממוקם באתר של שברים ומתפקד כפיגום כדי לסייע בתיקון גורמים וחלבונים להצטבר בקצוות שבורים18.
היעדר מעצר מחזור התא בעקבות נזק לדנ"א נובע ממחסום נזק DNA לא מספיק המאפשר לביציות עם DNA לא מתוקן להיכנס מחדש למיוזה. בעקבות רמות גבוהות של נזק לדנ"א, מחסום יכול לשמור על מעצר שלב באמצעות הפעלת מסלול תלוי ATM/Chk1. תגובת הבידוק המוגבלת ל-DSB נובעת מההפעלה המוגבלת של כספומט17,19. בשלב M של מיוזה I, מחקרים הראו כי נזק לדנ"א עשוי להפעיל מחסום מיוזה I המושרה על ידי ציר (SAC), אשר מונע את ההפעלה של E3 ubiquitin ligase anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C) ולכן, יציאה משלב M. יתר על כן, אבלציה של חלבוני SAC מתגברת על מצב של מעצר שלב M, ובכך מדגישה את חשיבותו של SAC בביסוס המיוזה I chekpoint20.
כפי שמחקרים קודמים מראים בבירור, DSBs אינם יכולים לגרום למחסום פאזה חזק בביציות עכבר. אם נזק כזה לא יתוקן, הוא עלול להוביל לעוברים הנושאים הפרעות כרומוזומליות. לכן, חשוב לחקור את תגובת הנזק לדנ"א בשלבים שונים של הגמטוגנזה הנשית כדי להבין טוב יותר את המסלולים הייחודיים שבהם הביציות משתמשות כדי להתמודד עם עלבונות גנטיים פוטנציאליים.
כל ניסויי העכברים אושרו על ידי הרשויות המקומיות (אזור יואנינה, יוון) ונערכו בהתאם להנחיות מועצת הקהילות האירופית 2010/63/EU. ניסויים נערכו ביחס לעקרונות של 3Rs. כל עכברי CD-1 ששימשו לניסויים הוחזקו במתקן בית החיות של אוניברסיטת יואנינה, יוון, בחדר עם טמפרטורה מבוקרת (22 מעלות צלזיוס) ולחות (60%) והוזנו אד ליביטום. לבית החיות רישיון להפעלת מתקן לרבייה (EL33-BIObr01), אספקה (EL33-BIOsup01) וניסויים (EL33BIO-exp01).
1. הכנת ריאגנטים
2. איסוף ביציות GV משחלות מנותחות והשראת DSB
הערה: כל הכלים והפתרונות צריכים להיות סטריליים. הטיפול בביציות מתבצע באמצעות פיפטה בפה תחת מיקרוסקופ סטריאו (ראו טבלת חומרים), וכל הטיפות מכוסות בשמן מינרלי (ראו טבלת חומרים ואיור 1E).
איור 1: תהליך בידוד ביציות . (A) הסרת רקמת שומן פרי-שחלתית ושאריות מקטעי חצוצרה משחלות בתווך M2 עם IBMX. התצלום מתקבל דרך עיניות המיקרוסקופ הסטריאופוני. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. (B) שחלות מבודדות בתווך M2 עם IBMX. התמונה התקבלה דרך עיניות המיקרוסקופ הסטריאופוני. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. (C) ניקוב מכני של השחלות באמצעות מחט 27 G בתווך M2 עם IBMX. התמונה התקבלה דרך עיניות המיקרוסקופ הסטריאופוני. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. (D) COC המשתחררים מהשחלות לאחר ניקוב בתווך M2 עם IBMX. התמונה התקבלה דרך עיניות המיקרוסקופ הסטריאופוני. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (E) איסוף ביציות באמצעות פיפטה בפה. (F) ביציות דנודיות, לאחר הסרת תאי הקומולוס שמסביב, בתווך M2 עם IBMX. התמונה התקבלה דרך עיניות המיקרוסקופ הסטריאופוני. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
3. קיבוע ביציות ואימונופלואורסנציה
הערה: הטיפול בביציות מתבצע באמצעות פיפטה בפה תחת מיקרוסקופ סטריאו, וכל הטיפות מכוסות בשמן מינרלי.
4. מיקרוסקופ קונפוקלי
הערה: יש לבצע מיקרוסקופ קונפוקלי באופן מיידי כדי למנוע את הירידה בעוצמת הפלואורסצנטיות לאחר מיקום הביציות בכלים בעלי תחתית זכוכית. נדרשת גישה למיקרוסקופ קונפוקלי (ראה טבלת חומרים) עם במה ממונעת.
איור 2: מיקרוסקופ קונפוקלי. (A) ביציות קבועות לאחר ביצוע פרוטוקול אימונופלואורסנציה וצביעת דנ"א, שנמצאות בטיפות נפרדות של חיץ כביסה, מכוסות בשמן מינרלי, מונחות בכלי עם תחתית זכוכית ומוכנות להדמיית מיקרוסקופ קונפוקלי. כל טיפה מכילה קטגוריה ניסיונית אחרת. התמונה התקבלה דרך עיניות המיקרוסקופ הסטריאופוני. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ/100 מיקרומטר עבור החלק המוגדל. (B) פלטה בעלת תחתית זכוכית המונחת על במת המיקרוסקופ הקונפוקלי. (C) תמונת שדה בהיר של ביציות המתקבלת באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (D) מערכת המיקרוסקופ הקונפוקלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
5. ניתוח הדמיה
באמצעות ההליך שהודגם כאן, נותחו שחלות עכברים, הוסר השומן ונאספו ביציות מלאות בשלב GV. לאחר מכן, תאי הקומולוס הוסרו על-ידי פיפטינג חוזר ונשנה באמצעות פיפטה צרה, והונחו בטיפות טריות של מדיום M2-IBMX וכוסו בשמן מינרלי על בלוק חם (37°C) (איור 1A-F). הוכנו שלושה ריכוזי אטופוסיד שונים (5 מק"ג/מ"ל, 20 מק"ג/מ"ל ו-50 מק"ג/מ"ל) באמצעות ריכוז אטופוסיד מלאי של 20 מ"ג/מ"ל. הביציות בשלב GV הוכנסו לשלושה ריכוזים אטופוזידים נפרדים למשך שעה אחת בטיפות המכוסות בשמן מינרלי ומוגנות מפני אור בטמפרטורה של 37°C. לאחר מכן בוצע פרוטוקול האימונופלואורסנציה, כפי שמתואר בסעיף הפרוטוקול בפירוט, והביציות הונחו בצלחות עם תחתית זכוכית ונצפו במיקרוסקופ קונפוקלי (איור 2).
בביציות בשלב SN GV, מיד לאחר נזק לדנ"א, נוכחות γH2AX עלתה בכל ריכוזי האטופוזידים (5 מיקרוגרם/מ"ל, 20 מק"ג/מ"ל ו-50 מק"ג/מ"ל), וה-γH2AX פוזר בכל אזור הדנ"א (איור 3). כימות ואומדן DSB בוצעו על ידי צפייה בעוצמת הפלואורסצנטיות γH2AX באתרי DNA. הפלואורסצנטיות γH2AX התעצמה באופן יחסי עם עליית ריכוזי האטופוסידים. יתר על כן, לאחר מעצר שלב ממושך (20 שעות לאחר טיפול אטופוסידי), הביציות בשלב GV הראו את היכולת להפחית את מספר מוקדי γH2AX ואת עוצמתם, מה שמרמז על נוכחות של תהליכי תיקון פעילים בביציות שנעצרו בשלב GV (איור 3E).
בניגוד לביציות SN, שבהן הפלואורסצנטיות γH2AX הופצה דרך הדנ"א, בביציות NSN, γH2AX הוצג במוקדים מיד לאחר הטיפול באטופוסיד ב 20 מיקרוגרם / מ"ל. הערכנו את מספר המוקדים שחפפו לאזור הדנ"א, חישבנו את הפלואורסצנטיות של כל מוקד, והצגנו את הפלואורסצנטיות הממוצעת של כל הביציות. גם הפלואורסצנטיות וגם מספר המוקדים הראו הבדלים מובהקים סטטיסטית בין שתי קטגוריות הביציות (איור 4).
מיקרוסקופ קונפוקלי מספק מידע על מספר ועוצמת המוקדים בערימות Z שונות, ובכך מסייע לזהות את נוכחות הנזק לדנ"א ואת דינמיקת התיקון בנקודות זמן שונות. סריקת Galvano מספקת סריקה מדויקת עם רקע נמוך וניתוח טוב יותר של תמונות הסריקה.
איור 3: הפחתה של γH2AX בביציות בשלב SN GV שטופלו בשלושה ריכוזי אטופוסיד שונים לאחר מעצר GV ממושך. (A) פלואורסצנטיות γH2AX בביציות SN GV שלב 0 שעות לאחר טיפול אטופוסידי. γH2AX עולה מיד לאחר החשיפה בכל ריכוזי האטופוסידים, והעלייה תלויה בריכוז (ירוק: γΗ2ΑΧ, מגנטה: DNA). התמונות הן הקרנות Z-stack, והבהירות/ניגודיות הותאמו לכל ערוץ באמצעות Fiji / ImageJ. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. (B) גרף של פלואורסצנטיות γH2AX בביציות SN GV שלב 0 שעות לאחר הטיפול עם ריכוזי אטופוסיד מובהקים. הנתונים מייצגים ממוצע ± SEM. כל נקודה מייצגת ביצית אחת (מספר הביציות מוצג בגרף), (ns = לא מובהק, ** p < 0.005, **** p < 0.0001, ANOVA חד כיווני עם מבחן השוואות מרובות של Tukey). (C) γH2AX פלואורסצנטיות בביציות בשלב SN GV 20 שעות לאחר טיפול אטופוסידי. γH2AX מפחית 20 שעות לאחר החשיפה בכל ריכוזי האטופוסיד (ירוק: γΗ2ΑΧ, מגנטה: DNA). התמונות הן הקרנות מסוג Z-stack, והבהירות/ניגודיות הותאמו לכל ערוץ באמצעות Fiji/ImageJ. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. (D) גרף של פלואורסצנטיות γH2AX בביציות SN GV שלב 20 שעות לאחר הטיפול עם ריכוזי אטופוסיד מובהקים. הנתונים מייצגים ממוצע ± SEM. כל נקודה מייצגת ביצית אחת (מספר הביציות מוצג בגרף), (ns = לא מובהק, * p < 0.05, * * p < 0.005, *** p < 0.0005, **** p < 0.0001, ANOVA חד כיווני עם מבחן השוואות מרובות של Tukey). (E) גרף עמודות של הפחתת פלואורסצנטיות γH2AX בביציות בשלב SN GV לאחר מעצר שלב בביציות שטופלו באטופוזיד. המספר מעל כל עמודה מציין את אחוז הירידה בפלואורסצנטיות γH2AX. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: זרחן של Η2ΑΧ בביציות בשלב GV של NSN לאחר טיפול באטופוסיד ב-20 מיקרוגרם/מ"ל. (A) תמונות קונפוקליות מייצגות של ביצית NSN GV אחת (ירוק: γΗ2ΑΧ, מגנטה: DNA). התמונות הן הקרנות מסוג Z-stack, והבהירות/ניגודיות הותאמו לכל ערוץ באמצעות Fiji/ImageJ. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. (B) תמונות קונפוקליות מייצגות של ביצית NSN GV אחת שטופלה באטופוסיד (ירוק: γΗ2ΑΧ, מגנטה: DNA). הביציות תוקנו 0 שעות לאחר טיפול אטופוסידי. התמונות הן הקרנות מסוג Z-stack, והבהירות/ניגודיות הותאמו לכל ערוץ באמצעות Fiji/ImageJ. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. (C) הפלואורסצנטיות γΗ2ΑΧ המנורמלת בביציות בשלב GV של NSN לאחר טיפול אטופוסיד של 20 מיקרוגרם/מ"ל. הנתונים מייצגים ממוצע ± SEM. כל נקודה מייצגת ביצית אחת (מספר הביציות מוצג בגרף), שנלקחה משני ניסויים עצמאיים (**** p < 0.0001, מבחן t לא פרמטרי לא מזווג, מבחן U-Mann-Whitney). (D) מספר מוקדי γΗ2ΑΧ בביציות בשלב NSN GV לאחר טיפול אטופוסיד של 20 מיקרוגרם/מ"ל. הנתונים מייצגים ממוצע ± SEM. כל נקודה מייצגת ביצית אחת (מספר הביציות מוצג בגרף), שנלקחה משני ניסויים עצמאיים (**** p < 0.0001, מבחן t לא פרמטרי לא מזווג, מבחן U-Mann-Whitney). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
באמצעות השיטה המתוארת כאן, זיהינו DSB בביציות יונקים. שיטה זו מאפשרת איתור ולימוד של תהליך תיקון הדנ"א בביציות. אותו פרוטוקול יכול לשמש גם לניתוח חלבונים אחרים המשתתפים בתהליכים פיזיולוגיים בביציות יונקים. חשוב לחקור כיצד הביציות מגיבות לנזק פוטנציאלי לדנ"א על מנת להבין טוב יותר את הגורם לתת-פוריות נשית בבני אדם.
חקר תגובת הנזק לדנ"א בביציות יונקים יכול להיות מאתגר בגלל הרגישות של הביציות. טיפול בביציות דורש טמפרטורות ספציפיות וריכוזי CO 2ו-O 2. יחד עם זאת, הביציות חייבות להיות מוגנות מפני אור. הטיפול צריך להיעשות על ידי שימוש בפיפטות זכוכית שאינן צרות, שכן הדבר עלול להזיק לביציות, אך גם לא לרוחב, שכן הדבר עלול לגרום לדילול המדיום ובכך להשפיע לרעה על הליך הקיבוע. בכל שלב של קיבוע, כמה טיפות של חוצצים משמשים כדי למזער את אפקט דילול. דרך חלופית לתצפית ב-DSB היא בדיקת השביט24. למרות שטכניקה זו רגישה יותר, היא מורכבת יותר. יחד עם זאת, באמצעות שימוש בניסוי השביט לא ניתן לזהות את אזור הדנ"א המדויק שבו מתרחש הנזק, ובתאים עם מולקולות רנ"א בשפע, כמו ביציות בשלב GV 25, הרקע יכול להיות מוגבר, מה שיוביל לאות נזק כוזבלדנ"א26.
על ידי שימוש בפרוטוקול immunofluorescence המתואר כאן, אנו יכולים לזהות DSB בדיוק ולהעריך את התקדמות התיקון בביציות בשלב GV, כפי שמצוין על ידי הפחתת פלואורסצנטיות γH2AX לאורך זמן. עם זאת, מגבלה אחת של שיטה זו היא כי נוגדנים מסוימים עשויים להציג פיזור לא ספציפי ברחבי ooplasm, ובכך להוביל תמונות עם פלואורסצנטיות רקע גבוהה. מאגר PFA-Tx-100 משמש במקום PFA רציף ו- Tx-100, כפי שראינו כי הוא משפר את תהליך הקיבוע בכך שהוא מאפשר זיהוי של פחות רקע ופלואורסצנטיות לא ספציפית. מגבלה שנייה של שימוש ב- γH2AX לזיהוי DSB היא שלא ניתן להעריך נזק לאחר GVBD בגלל הזרחן הספונטני של γH2AX במיוזה23.
בפרוטוקול אימונופלואורסנציה זה, הביציות נשארות במאגר נוזלי ולא ניתן לאחסן אותן בתוך שקופיות. עובדה זו מקשה על שימור התאים הקבועים במשך ימים לאחר הוספת הנוגדן המשני. על מנת להשיג תמונות באיכות טובה ולא לאבד אות, עדיף לבצע את ההדמיה תוך מספר שעות לאחר הוספת הנוגדן המשני. כמו כן יש לציין כי סריקת הגרעינים דרך ציר Z עלולה לגרום לאות להיחלש עקב חשיפת יתר. מסיבה זו, עדיף להוריד את עוצמת הלייזר ולהגביר את מהירות הסריקה.
לבסוף, מגבלה נוספת של פרוטוקול האימונופלואורסנציה היא שניתן להשתמש בו רק עבור תאים קבועים / לא חיים. לכן, אנו יכולים להעריך רק את נוכחותם והיעדרם של גורמים בנקודות זמן ספציפיות מבלי לדעת אם יש תנודות בריכוזם או שינויים בהתנהגותם לאורך זמן. ניתן להתגבר על בעיה זו באמצעות דימות תאים חיים וסמנים מתויגים פלואורסצנטית.
אנו מודים על תמיכה בעבודה זו מהפרויקט "הקמת תשתיות 'בניית יכולות' במחקר ביו-רפואי (BIOMED-20)" (MIS 5047236), המיושם במסגרת הפעולה "חיזוק תשתית המחקר והחדשנות", במימון התוכנית האופרטיבית "תחרותיות, יזמות וחדשנות" (NSRF 2014-2020), ובמימון משותף של יוון והאיחוד האירופי (הקרן האירופית לפיתוח אזורי).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
3 mL Pasteur pipettes in LDPE, graduated | APTACA | 1502 | |
10 cc syringes | SoftCare | 114.104.21 | |
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit Secondary Ab | Biotium | 20012 | |
Anti-phospho-H2A.X (Ser139) | Merck Millipore | 07-164 | |
ARE Heating Magnetic Stirrer | VELP Scientifica | F20500162 | |
BD FALCON 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tubes | BD Biosciences | 352054 | |
BD Microlance 3 Needles 27 G - 0.40 x 13 mm | Becton Dickinson | 300635 | |
Bovine Serum Albumin Fraction V | Roche | 10735078001 | |
DMSO Anhydrous | Biotium | 90082 | |
DRAQ7 DNA dye | BioStatus | DR71000 | |
EGTA | Sigma-Aldrich | E4378-25G | |
EMSURE MgCl2. 6H2O | Merck Millipore | 1058330250 | |
Etoposide | CHEMIPHARM | L01CB01 | |
FALCON 14 mL Polystyrene Round-Bottom Tubes | Corning Science | 532057 | |
FALCON Tissue Culture Dishes, Easy-Grip, 35 x 10 mm Style | Corning Science | 353001 | |
Glass Bottom Culture Dishes (35 mm Petri dish/ 14 mm Microwell, No. 0 coverglass) | MatTek Corporation | P35G-0-14-C | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H6147-25G | |
HERACELL 150i CO2 Incubator | ThermoFisher Scientific | 50116048 | |
IBMX powder | Sigma-Aldrich | I5879-100MG | |
Leica M125 Stereo Microscope | Leica Microsystems | ||
M16 Medium | Sigma-Aldrich | M7292 | |
M2 Medium | Sigma-Aldrich | M7167 | |
Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M5310 | |
NaN3 | Honeywell | 13412H | |
NaOH | Merck Millipore | 1064981000 | |
Nikon AX ECLIPSE Ti2 Confocal Microscope | Nikon Corporation | ||
Nikon SMZ800N Stereo Microscope | Nikon Corporation | ||
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
Pasteur pippettes, glass, long form 230 mm | DURAN WHEATON KIMBLE | 357335 | |
pH/ORP meter | Hanna Instruments Ltd | HI2211 | |
Phosphate buffered saline tablets | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
PIPES | Sigma-Aldrich | P1851 | |
PMSG Protein Lyophilised | Genway Biotech (now AVIVA Systems Biology) | GWB-2AE30A (now OPPA01037) | |
QBD4 Dry block heater | Grant Instruments (Cambridge) Ltd | A25218 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
Whatman Puradisc 25 mm 0.2 μm filters | GE Healthcare | 6780-2502 |
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved