Vi vil gerne takke Nick Russell og Brandon McKethan fra Bio-Rad for deres nyttige diskussioner under udviklingen af denne metode.

Kvantificering af virale vektorer i tårer ved hjælp af ddPCR til bioshedding-undersøgelser

<ol>
	<li>Sherkow, J. S., Zettler, P. J., Greeley, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+it+'gene+therapy.">Is it 'gene therapy.</a> Journal of Law and the Biosciences. 5 (3), 786-793 (2018).</li><li>Ginn, S. L., Amaya, A. K., Alexander, I. E., Edelstein, M., Abedi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+clinical+trials+worldwide+to+2017:+an+update.">Gene therapy clinical trials worldwide to 2017: an update.</a> The Journal of Gene Medicine. 20 (5), 3015 (2018).</li><li>Ghosh, S., Brown, A. M., Jenkins, C., Campbell, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vector+systems+for+gene+therapy:+a+comprehensive+literature+review+of+progress+and+biosafety+challenges.">Viral vector systems for gene therapy: a comprehensive literature review of progress and biosafety challenges.</a> Applied Biosafety. 25 (1), 7-18 (2020).</li><li>Gene, Cell, &amp; RNA therapy landscape, Q4 2022 quarterly data report. American Society for Gene &amp; Cell Therapy Available from: <a target="_blank" href="https://asgct.org/global/documents/asgct_citeline-q4-2022-report_final.aspx">https://asgct.org/global/documents/asgct_citeline-q4-2022-report_final.aspx</a> (2022)</li><li>Approved Cellular and Gene Therapy Products. United States Food and Drug Administration Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/vaccines-blood-biologics/cellular-gene-therapy-products/approved-cellular-and-gene-therapy-products">https://www.fda.gov/vaccines-blood-biologics/cellular-gene-therapy-products/approved-cellular-and-gene-therapy-products</a> (2022)</li><li>Au, H. K. E., Isalan, M., Meilcarek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+advances:+a+meta-analysis+of+AAV+usage+in+clinical+settings.">Gene therapy advances: a meta-analysis of AAV usage in clinical settings.</a> Frontiers in Medicine. 8, 809118 (2022).</li><li>Lundstrom, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vectors+in+gene+therapy.">Viral vectors in gene therapy.</a> Diseases. 6 (2), 42 (2018).</li><li>Naso, M. F., Tomkowicz, B., Perry, W. L., Strohl, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+(AAV)+as+a+vector+for+gene+therapy.">Adeno-associated virus (AAV) as a vector for gene therapy.</a> BioDrugs. 31, 317-334 (2017).</li><li>Russell, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+voretigene+neparvovec+(AAV2-hRPE65v2)+in+patients+with+RPE65-mediated+inherited+retinal+dystrophy:+a+randomized,+controlled,+open-label,+phase+3+trial.">Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: a randomized, controlled, open-label, phase 3 trial.</a> Lancet. 390 (10097), 849-860 (2017).</li><li>Chemistry, manufacturing, and control (CMC) information for human gene therapy investigational new drugs (INDs). United States Food and Drug Administration Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/chemistry-manufacturing-and-control-cmc-information-human-gene-therapy-investigationsal-new-drug">https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/chemistry-manufacturing-and-control-cmc-information-human-gene-therapy-investigationsal-new-drug</a> (2020)</li><li>Long term follow-up after administration of human gene therapy products. United States Food and Drug Administration Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/long-term-follow-after-adminstration-human-gene-therapy-products">https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/long-term-follow-after-adminstration-human-gene-therapy-products</a> (2020)</li><li>Testing of retroviral vector-based human gene therapy products for replication competent retrovirus during product manufacture and patient follow-up. United States Food and Drug Administration Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/testing-retroviral-vector-based-human-gene-therapy-products-replication-competent-retrovirus-during">https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/testing-retroviral-vector-based-human-gene-therapy-products-replication-competent-retrovirus-during</a> (2020)</li><li>Recommendations for microbial vectors used in gene therapy. United States Food and Drug Administration Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/recommendations-microbial-vectors-used-gene-therapy">https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/recommendations-microbial-vectors-used-gene-therapy</a> (2016)</li><li>Multidisciplinary: gene therapy. European Medicines Agency Available from: <a target="_blank" href="https://www.europa.eu/en/human-regulatory-development/scientific-guidelines/multidisciplinary/multidisciplinary-gene-therapy">https://www.europa.eu/en/human-regulatory-development/scientific-guidelines/multidisciplinary/multidisciplinary-gene-therapy</a> (2023)</li><li>Human gene therapy for retinal disorders. United States Food and Drug Administration Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/human-gene-therapy-retinal-disorders">https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/human-gene-therapy-retinal-disorders</a> (2020)</li><li>Design and analysis of shedding studies for virus or bacterial-based gene therapy and oncolytic products. United States Food and Drug Administration Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/design-and-analysis-shedding-studies-virus-or-bacteria-based-gene-therapy-and-oncolytic-products">https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/design-and-analysis-shedding-studies-virus-or-bacteria-based-gene-therapy-and-oncolytic-products</a> (2015)</li><li>Guideline on the quality, non-clinical and clinical aspects of gene therapy medicinal products. European Medicines Agency Available from: <a target="_blank" href="https://www.ema.europa.eu/en/documents/scientific-guideline/guideline-quality-non-clinical-clinical-aspects-gene-therapy-medicinal-products_en.pdf">https://www.ema.europa.eu/en/documents/scientific-guideline/guideline-quality-non-clinical-clinical-aspects-gene-therapy-medicinal-products_en.pdf</a> (2018)</li><li>Kaur, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=white+paper+on+recent+issues+in+bioanalysis:+mass+spec+of+proteins,+extracellular+vesicles,+CRISPR,+chiral+assays,+oligos;+nanomedicines+bioanalysis;+ICH+M10+section+7.1;+non-liquid+&amp;+rare+matrices;+regulatory+inputs+(part+1A+-+recommendations+on+endogenous+compounds,+small+molecules,+complex+methods,+regulated+mass+spec+of+large+molecules,+small+molecule,+PoC+&amp;+part+1B+-+regulatory+agencies'+inputs+on+bioanalysis,+biomarkers,+immunogenicity,+gene+&amp;+cell+therapy+and+vaccine).">white paper on recent issues in bioanalysis: mass spec of proteins, extracellular vesicles, CRISPR, chiral assays, oligos; nanomedicines bioanalysis; ICH M10 section 7.1; non-liquid &amp; rare matrices; regulatory inputs (part 1A - recommendations on endogenous compounds, small molecules, complex methods, regulated mass spec of large molecules, small molecule, PoC &amp; part 1B - regulatory agencies' inputs on bioanalysis, biomarkers, immunogenicity, gene &amp; cell therapy and vaccine).</a> Bioanalysis. 14 (9), 505-580 (2022).</li><li>Hays, A., Islam, R., Matys, K., Williams, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Best+practices+in+qPCR+and+qPCR+validation+in+regulated+bio+analytical+laboratories.">Best practices in qPCR and qPCR validation in regulated bio analytical laboratories.</a> The AAPS Journal. 24 (2), 36 (2022).</li><li>Ma, H., Bell, K. N., Loker, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=qPCR+and+qRT-PCR+analysis:+Regulatory+points+to+consider+when+conducting+biodistribution+and+vector+shedding+studies.">qPCR and qRT-PCR analysis: Regulatory points to consider when conducting biodistribution and vector shedding studies.</a> Molecular Therapy. Methods &amp; Clinical Development. 17 (20), 152-168 (2020).</li><li>Wissel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+on+qPCR/ddPCR+assay+validation+by+GCC.">Recommendations on qPCR/ddPCR assay validation by GCC.</a> Bioanalysis. 14 (12), 853-863 (2022).</li><li>Expectations for biodistribution (BD) assessments for gene therapy (GT) products. International Pharmaceutical Regulators Programme Available from: <a target="_blank" href="https://admin.iprp.global/sites/default/files/2018-09/IPRP_GTWG_ReflectionPaper_BD_Final_2018_0713.pdf">https://admin.iprp.global/sites/default/files/2018-09/IPRP_GTWG_ReflectionPaper_BD_Final_2018_0713.pdf</a> (2018)</li><li>Pinheiro, L., Emslie, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+concepts+and+validation+of+digital+PCR+measurements.">Basic concepts and validation of digital PCR measurements.</a> Methods in Molecular Biology. 1768, 11-24 (2018).</li><li>Tzonev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamentals+of+counting+statistics+in+digital+PCR:+I+measured+two+target+copies-what+does+it+mean.">Fundamentals of counting statistics in digital PCR: I measured two target copies-what does it mean.</a> Methods in Molecular Biology. 1768, 25-43 (2018).</li><li>Prantner, A., Marr, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+concentration,+characterization,+and+integrity+analysis+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors+using+droplet+digital+PCR.">Genome concentration, characterization, and integrity analysis of recombinant adeno-associated viral vectors using droplet digital PCR.</a> PLoS One. 18, 0280242 (2023).</li><li>Primer-BLAST. National Library of Medicine, National Center for Biotechnology Information Available from: <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nim.nih.gov/tools/primer-blast/">https://www.ncbi.nim.nih.gov/tools/primer-blast/</a> (2023)</li><li>Koressaar, T., Remm, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancements+and+modifications+of+primer+design+program+Primer+3.">Enhancements and modifications of primer design program Primer 3.</a> Bioinformatics. 23 (10), 1289-1291 (2007).</li><li>Ye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer-BLAST:+A+tool+to+design+target-specific+primers+for+polymerase+chain+reaction.">Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction.</a> BMC Bioinformatics. 13, 134 (2012).</li><li>Droplet Digital PCR Application Guide. Bio-Rad Available from: <a target="_blank" href="https://www.bio-rad.com/webroot/we/pdf/lsr/literature/Bulletin_6407.pdf">https://www.bio-rad.com/webroot/we/pdf/lsr/literature/Bulletin_6407.pdf</a> (2023)</li><li>Qian, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dPCR:+A+technology+review.">dPCR: A technology review.</a> Sensors. 18 (4), 1271 (2018).</li><li>Basu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+assays+part+I:+portioning+statistics+and+digital+PCR.">Digital assays part I: portioning statistics and digital PCR.</a> SLAS Technology. 22 (4), 369-386 (2017).</li><li>Sanmiguel, J., Gao, G., Vandeberghe, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+digital+droplet-based+AAV+genome+titration.">Quantitative and digital droplet-based AAV genome titration.</a> Methods in Molecular Biology. 1950, 51-83 (2019).</li><li>Bachhuber, F., Huss, A., Senel, M., Tumani, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+biomarkers+in+tear+fluid:+from+sampling+to+preanalytical+processing.">Diagnostic biomarkers in tear fluid: from sampling to preanalytical processing.</a> Scientific Reports. 11, 10064 (2021).</li><li>Martinez-Fernandez de la Camara, C., McClements, M. E., MacLaren, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+quantification+of+AAV+vector+genomes+by+quantitative+PCR.">Accurate quantification of AAV vector genomes by quantitative PCR.</a> Genes. 12 (4), 601 (2021).</li><li>Ai, J., Ibraheim, R., Tai, P. W. L., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+scalable+and+accurate+method+for+quantifying+vector+genomes+of+recombinant+adeno-associated+viruses+in+crude+lysate.">A scalable and accurate method for quantifying vector genomes of recombinant adeno-associated viruses in crude lysate.</a> Human Gene TherapyMethods. 28 (3), 139-147 (2017).</li><li>Dobnik, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+quantification+and+characterization+of+adeno-associated+viral+vectors.">Accurate quantification and characterization of adeno-associated viral vectors.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1570 (2019).</li><li>Bennett, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+stability+as+a+determinant+of+AAV+serotype+identity.">Thermal stability as a determinant of AAV serotype identity.</a> Molecular Therapy Methods and Clinical Development. 6, 171-182 (2017).</li></ol>

Alle forfattere er ansatte i KCAS Bioanalytical and Biomarker Services, en kontraktforskningsorganisation, der leverer omfattende udviklingstjenester i overensstemmelse med god laboratoriepraksis / god klinisk praksis fra tidlig opdagelsesstøtte gennem produktregistrering, herunder understøttende AAV-baserede assays, som beskrevet i denne protokol. KCAS finansierede dette projekt og offentliggørelsen af denne protokol. Selvom der ikke er nogen nuværende FDA-retningslinjer for design og validering af de eksperimenter, der præsenteres i dette papir, har eksperterne og tankelederne, der udvikler sådanne undersøgelser på KCAS, vedtaget denne tilgang som basislinjetilgang. Yderligere kriterier og parametre drøftes for hvert enkelt projekt og kan medtages på grundlag af den tilsigtede anvendelse.

Der er flere trin i ddPCR-protokollen, der er afgørende for korrekt udførelse af analysen. Det første kritiske trin er design og optimering af primere og sonde. Generelt anbefales brugen af hydrolysesondebaseret kemi frem for farvestofbaseret kemi (f.eks. SYBR Green) i prækliniske eller kliniske omgivelser på grund af deres overlegne specificitet. Derudover er valget af forstærkningsmål kritisk. Typisk er vektorens transgen af interesse målrettet. I tidligere prækliniske stadier eller i vektorer, hvor det måske ikke er muligt at skelne vektortransgen versus genomisk DNA, kan det imidlertid være hensigtsmæssigt at anvende standardiserede vektormål. For eksempel kan man målrette mod den inverterede terminalgentagelsesregion, promotor, poly-A-hale eller krydsene mellem segmenterne mellem disse vektorkomponenter. Valget af mål varierer afhængigt af vektordesign. Traditionelle qPCR-primer- og sondedesignstrategier og software er typisk passende til ddPCR. Designparametre, der forventes at give en ensartet udglødningstemperatur (f.eks. 60 °C), bør vælges for at reducere den nødvendige optimering. Det er også blevet anbefalet at designe, bestille og evaluere mindst tre forskellige sæt for hvert mål. Man bør derefter vælge det sæt, der viser den største specificitet (ingen forstærkning i den negative kontrolbrønd eller i en matrix af relateret mål-DNA) og følsomhed (dvs. detektionsgrænse)20.
Hvis det er fordelagtigt at kunne overføre analysen mellem qPCR og ddPCR, anbefales det først at optimere analysebetingelserne ved hjælp af qPCR og identificere betingelser for det valgte sæt, der resulterer i forstærkningseffektivitet på 90% -110% med en R2 ≥ 0,98. Imidlertid er ddPCR som en endepunktsmetode typisk mindre følsom end qPCR på grund af varians i forstærkningseffektivitet. Som minimum anbefales det at køre en termisk temperaturgradient i udglødnings-/forlængelsestrinnet for at dække temperaturer over og under de forventede udglødningstemperaturer og for at evaluere regn- og fluorescerende amplitudeadskillelsen mellem de negative og positive dråbeklynger som funktion af temperaturen. Hvis arbejdsområdet tillader det, anbefales det at have individuelle dedikerede arbejdsstationer til forberedelse af mastermix, tilføjelse af skabeloner og forstærkning. Hvor det er muligt, bør disse fysisk adskilles af en ensrettet arbejdsgang med indbyggede tekniske kontroller, såsom kontrolleret adgang og differenslufttryk, for at reducere risikoen for krydskontaminering og falske positiver. Hvis dette ikke er muligt, skal der udvises ekstrem forsigtighed for at undgå krydskontaminering.
Der er to trin i denne protokol, der kan virke usædvanlige for dem, der er mere vant til qPCR-assayudvikling. Den første er inkluderingen af et restriktionsenzym i PCR-masterblandingen. Under ddPCR-amplifikation termocykles hver dråbe til slutpunktet. I et korrekt optimeret assay resulterer dette i to populationer af dråber, et sæt viser et konsekvent højt niveau af fluorescerende signaler - positiverne - og et andet viser konsekvent et lavt niveau af fluorescerende signal - negativerne. Hvis PCR-interferens opstår, kan det desynkronisere initieringen af PCR-amplifikation, hvilket resulterer i, at dråben ikke når et forstærkningsplateau og dermed inkonsekvente fluorescerende endepunkter. I dette tilfælde fordeles dråberne mellem negativerne og positive, hvilket resulterer i et fænomen kaldet ddPCR-regn. Dette kan resultere i unøjagtig kvantificering af målet og inkonsekvent og subjektivt anvendte tærskler. Vores anbefaling om at sætte tærsklen lidt over NTC-signalet, hvilket bør minimere virkningerne af regn i den endelige kvantificering, da alle dråber stadig betragtes som positive, selvom de ikke er fuldt cyklet til slutpunktet. AAV'er har en meget kompleks sekundær struktur, der afhængigt af forstærkningsmålet kan reducere tilgængeligheden til primere og sonder, hvilket resulterer i PCR-interferens og dermed regn. Inkluderingen af restriktionsenzymet i masterblandingen spalter denne sekundære struktur for at øge adgangen for primere og sonder, hvilket reducerer regnen, hvilket derved kan forbedre nøjagtigheden af analysen. Virkningerne af inklusion af et restriktionsenzym i ddPCR-reaktionen er tidligere beskrevet 25,32. Ethvert restriktionsenzym kan anvendes, så længe det bekræftes, at det ikke skæres inden for målamplifikationsområdet. Der kræves ingen forfordøjelsestrin eller alternative buffersammensætninger.
Det andet usædvanlige trin er forberedelsen af tåreprøven indeholdende AAV. I denne protokol blev der anvendt et forhold på 1:10 (eller mere) mellem tårer, og efterfølgende blev prøven opvarmet. Når tårer opsamles via et kapillarrør, som er en meget anvendt indsamlingsmetode, kan der i gennemsnit opsamles ca. 10,0 μL33. Fortyndingen hjælper med at adressere det begrænsede prøvevolumen og give tilstrækkeligt materiale til dobbeltbrøndtestning. Selvom dette reducerer den teoretiske detektionsgrænse, bør ddPCR's robuste følsomhed stadig resultere i påvisning af alle undtagen et ekstremt få antal vektorpartikler. Denne tilgang skaber desuden en "backup" brønd, hvis man uventet skulle mislykkes. I dette tilfælde eller i tilfælde af utilstrækkelig prøvevolumen til at køre to brønde kan Poisson-fejlen bruges til at vurdere præcision. I tilfælde, hvor koncentrationen ligger under detektionsgrænsen, skaber det desuden mulighed for at sammenlægge brønddata for at bestemme en koncentration. Det er nødvendigt at frigøre AAV-vektorerne fra de virale kapsider til ddPCR-detektion. Nogle metoder til kvantificering af AAV har inkluderet et proteinase K fordøjelsestrin for at fjerne det virale kapsid34,35,36. Alle naturligt forekommende AAV-serotyper har smeltetemperaturer på eller under ca. 90 °C, hvoraf de fleste falder til under 80 °C. Dette synes derfor at være en unødvendig medtagelse37. Opvarmning alene synes at være tilstrækkelig til at frigive vektor-DNA.
Desuden er ddPCR generelt mindre modtagelig for PCR-hæmmere, der kan være til stede i en prøve, der kan påvirke et qPCR-assay. Hvis et specifikt DNA-isolationstrin er inkluderet, vil dette også kræve specifik validering, hvilket undgås i denne protokol. Prøver fortyndes før opvarmning på grund af kinetikken for diffusion af vektorgenomerne i en væske. Under opvarmningen og den efterfølgende afkølingsproces kan de positive og negative sansstrenge i det enkeltstrengede DNA-genom annealere sammen for at producere et dobbeltstrenget mellemprodukt, hvis koncentrationerne er tilstrækkeligt høje. Fortynding før opvarmning reducerer koncentrationerne og gør det matematisk usandsynligt, at der dannes tilstrækkeligt dobbeltstrengede mellemprodukter til at have en negativ indvirkning på kvantificeringens nøjagtighed. Det skal bemærkes, at de syntetiske DNA-fragmenter eller lineariserede plasmider, der anvendes som kvalitetskontrol, ikke må gennemgå dette opvarmningstrin. Da disse er dobbeltstrengede, vil opvarmning resultere i konvertering til enkeltstrengede mellemprodukter. Efter uafhængig opdeling af disse enkeltstrengede QC'er i dråber forventes dette at resultere i en dobbelt stigning i QC-koncentrationen i forhold til den nominelle koncentration. Alternativt, hvis QC'er skal opvarmes for at standardisere metoden, skal dette indregnes i rekonstitutionen og tildelingen af en nominel koncentration.
Endelig, med hensyn til prøveforberedelse, anbefaler mange protokoller også inkludering af et DNase-behandlingstrin for at fjerne ethvert uindkapslet vektor-DNA. Dette trin er kritisk i tilfælde, hvor det ikke ønskes at kvantificere frit DNA forbundet med vektorpræparatet (såsom under kvantificering til doseringsformål). Men i forbindelse med biodistributions- og bioshedding-undersøgelser ønsker man typisk at vide, hvor ethvert vektor-DNA har rejst, uanset om det er indkapslet eller ej. Derfor foreslås det typisk ikke at udføre et DNase-behandlingstrin under sådanne undersøgelser. Hvis det fastslås, at det er nødvendigt at inkludere et DNase-trin, skal dette trin være før fortynding og opvarmning.
I dette papir præsenteres data, der er repræsentative for tilgangen til vurdering af metodens dynamiske område, følsomhed, nøjagtighed og præcision inden for rammerne af en formålstjenlig, god laboratoriepraksis-kompatibel validering. Den nuværende mangel på vejledning om dette emne overlader valideringslaboratorierne til selv at fastlægge målanalysekriterier i overensstemmelse med den nuværende branchetænkning. Forskellige grupper har opstillet både højere og lavere målkriterier end anvendt i denne undersøgelse 19,20,21,22,23,24,25. Kriterierne for målassay bør, indtil de er mere strengt defineret, vælges forud for validering baseret på metodens tilsigtede kliniske anvendelser. Afhængigt af de downstream-beslutninger, der skal træffes på grundlag af dataene, kan der være behov for større nøjagtighed og præcision. Omvendt kan et simpelt positivt versus negativt resultat være tilstrækkeligt.
Tilgangen omfattede også anbefalinger til vurdering af specificitet og matrixeffekt. En pulje af tårer indsamlet fra ubehandlede individer kunne ikke give et positivt resultat i dette assay, mens målet kunne detekteres, når vektoren blev spidset ind i tårerne ved en høj og lav koncentration inden for de anbefalede restitutionshastigheder. Ideelt set ville matrix indeholdende endogen vektor (f.eks. indsamlet efter behandling med viral vektor) også indgå i disse vurderinger. Det er imidlertid usandsynligt, at sådanne prøver vil være tilgængelige til brug i en validering. For at øge valideringens robusthed kan flere puljer af tårer eller tårer indsamlet fra en række individer vurderes for at afgøre, om der opstår en patientspecifik matrixeffekt. Endelig anbefales det at evaluere stabiliteten. I arbejdsgange, hvor DNA-ekstraktion sker ud af den biologiske matrix, kan det være nødvendigt at evaluere stabiliteten af både prøven og det ekstraherede DNA. I denne arbejdsgang testes prøven direkte i analysen uden behov for DNA-ekstraktion. Derfor skal man i betragtning af evalueringen af stabiliteten for denne metode evaluere stabiliteten af tåreprøverne. Typisk anbefales bord-, køleskabs-, fryse-/optønings- og langsigtede stabilitetsvurderinger. Disse blev ikke udført som en del af denne undersøgelse, men de metoder, der er udviklet her, kan bruges i denne vurdering efter manipulationer af inputprøverne.
Samlet set har denne metode vist sig at være et robust, repeterbart og validereligt assay til påvisning af AAV-baserede vektorer i tåreprøver. Den kan tjene som en platform, der skal tilpasses specifikke vektorer til støtte for kliniske forsøg, og danner grundlag for validering af et assay, der er i overensstemmelse med god laboratoriepraksis.

Genterapidefinitionerne varierer, men inducerer generelt en tilsigtet og ofte forventet permanent veksling af en specifik DNA-sekvens af det cellulære genom for at modificere eller manipulere ekspressionen af et gen eller for at ændre en levende celles biologiske egenskaber til et klinisk formål 1,2. Virale vektorer bruges i stigende grad som køretøjer til genterapi på grund af deres effektivitet ved transduktion, med en rapport, der tyder på, at over 70% af de nuværende kliniske forsøg med genterapi bruger virale vektorer3. Interessen for virale vektorer til genterapi har været stigende. Kvartalsdatarapporten for kvartal 4 2022 om gen-, celle- og RNA-terapilandskabet fra American Society of Gene and Cell Therapy rapporterede, at i 2022 voksede gen-, celle- og RNA-terapipipelinen fra præklinisk til præregistrering med 7%, hvilket bragte det samlede antal terapier under udvikling til 3,726, hvoraf 2,053 (55%) var genterapier4. United States Food and Drug Administration (USA FDA) har i øjeblikket godkendt 27 celle- og genterapier til klinisk brug hos mennesker, hvoraf fem specifikt udnytter virale vektorer5.
Adeno-associerede vira (AAV'er) har fået særlig interesse som køretøjer til genterapi. En nylig metaanalyse afslørede, at der har været ca. 136 kliniske forsøg, der undersøger brugen af AAV'er i de sidste to årtier6. Derudover er tre af de fem FDA-godkendte genterapier i USA AAV-baserede. Dette skyldes deres meget redigerbare natur, brede værtsområde, der kan indstilles baseret på brugen af specifikke naturligt forekommende eller kunstigt konstruerede vektorer, lav patogenicitet og toksicitet hos mennesker og generelt lav immunogenicitet 7,8. AAV'er er også blevet anvendt med succes til behandling af okulære sygdomme i en godkendt klinisk indstilling. Voretigene neparvovec-rzyl er en AAV2-baseret terapi, der blev godkendt af USA FDA i 2017 og af Det Europæiske Lægemiddelagentur (EMA) i 2018 til behandling af biallelic RPE65 mutationsassocieret retinal dystrofi9.
Med stigende interesse for udviklingen af AAV-baserede terapier kommer behovet for lovgivningsmæssig vejledning om assays. Nøjagtig påvisning og kvantificering af enhver viral vektor er en integreret del af opdagelses-, fremstillings- og prækliniske/kliniske testfaser af produktudvikling. USA FDA er begyndt at udstede nogle retningslinjer for genterapier, herunder om kemi, fremstilling og kontrol til human genterapi forsøgsmæssige nye lægemiddelapplikationer 10, langsigtet opfølgning efter administration af genterapi 11, replikationskompetent retrovirustest12 og anbefalinger til mikrobielle vektorer, der anvendes i genterapier 13. EMA har også udgivet en række retningslinjer vedrørende udvikling af genterapiprodukter, der generelt er i overensstemmelse med FDA's anbefalinger, selv om der er visse forskelle14. Det er vigtigt at bemærke, at selv om disse retningslinjer ikke fastlægger juridisk bindende ansvar, undtagen hvor der henvises til specifikke regler, giver de klarhed om reguleringsagenturernes aktuelle tænkning om emnet og deres forventninger til analyser, der kræves til lægemiddelarkivering og myndighedsgodkendelse.
FDA anbefaler specifikt, at der udføres undersøgelser for at vurdere fordelingen, persistensen og clearance af en vektor fra administrationsstedet for at målrette okulært og ikke-okulært væv, intraokulære væsker og blod15. Disse tager form af biodistributions- og kasteundersøgelser. Biodistributionsundersøgelser evaluerer eksponering ved at undersøge, hvordan et produkt spredes gennem en patients krop fra administrationsstedet. Shedding evaluerer specifikt frigivelsen af produktet fra patienten til miljøet og øger muligheden for overførsel af vektoren til ubehandlede individer16. FDA fremsætter anbefalinger til design af biodistributions- og kasteundersøgelser med hensyn til hyppigheden af prøveindsamling, varigheden af prøveindsamlingen, typer af indsamlede prøver og opbevaringsbetingelser.
Derudover anbefaler FDA brugen af kvantitativ polymerasekædereaktion (qPCR eller PCR i realtid) til kvantitativ påvisning af vektorgenomer på grund af dets lette ydeevne, format med høj kapacitet, hurtige omdrejningstider og analysefølsomhed. Der er dog en relativ mangel på anbefalinger til design og ydeevnevurdering af molekylære metoder sammenlignet med dem, der findes for små og store molekyler. Mange af retningslinjerne for sådanne undersøgelser er vanskelige at anvende på molekylære metoder på grund af det unikke og komplekse design af både produkterne og selve analyserne, hvilket rejser spørgsmål om hensigtsmæssigheden af de tilgængelige platforme til de anbefalede vurderinger og passende metoder til validering af assay. Til dato har FDA ikke krævet formel validering af PCR-baserede assays, selvom EMA har pålagt dette krav17. I lyset af dette tomrum har forskellige grupper og workshops udstedt hvidbøger og anbefalinger, som producenter og kontraktforskningsorganisationer har forsøgt at følge 18,19,20,21,22,23,24,25. De fleste af disse anbefalinger er skrevet specifikt med qPCR-assays i tankerne, med forslag eller ændringer til nye platforme, såsom dråbe digital PCR (ddPCR), kun inkluderet som det anses for relevant. Nyere anbefalinger har fokuseret på overvejelser om ddPCR-assays, men har stort set fokuseret på deres anvendelser til vektorgenomkvantificering i en fremstillingsindstilling snarere end i de komplekse biologiske matricer, der er stødt på i bioshedding-undersøgelser.
Afhængigt af klinisk anvendelse og mål kan ddPCR foretrækkes frem for qPCR til støtte for biodistributions- og afgivelsesundersøgelser på grund af ddPCR's øgede følsomhed og evne til at håndtere matrixinterferens sammenlignet med qPCR. På grund af opdelingen af prøver i ca. 20.000 dråber kan der desuden opnås nøjagtig kvantificering af kopinummeret uden brug af en standardkurve ved hjælp af Poisson-statistik, hvilket forenkler metodeudvikling og validering. Målet med denne protokol er at beskrive en standardiseret tilgang til udvikling og validering af en ddPCR-baseret metode til påvisning af AAV-vektorer i tårer indsamlet fra den okulære overflade til støtte for kliniske bioshedding-undersøgelser.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AAV-eGFP Vector</td>
			<td>Charles River Laboratories</td>
			<td>RS-AAV2-FL</td>
			<td>Lot AAV2-0720-FL, used as a proof of principle vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoDG Droplet Digital PCR system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>QX200</td>
			<td>Alternative ddPCR system may be used following manufacturer&#8217;s protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoDG Oil for Probes</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1864110</td>
			<td>Or use material compatible with ddPCR system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Buffer Control for Probes</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1863052</td>
			<td>Or use material compatible with ddPCR system and PCR chemistry.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Droplet Reader Oil</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1863004</td>
			<td>Or use material compatible with ddPCR system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Piercable Foil Seals</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1814040</td>
			<td>Or use material compatible with ddPCR system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Plates 96-Well, Semi-Skirted</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>12001925</td>
			<td>Or use material compatible with ddPCR system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Supermix for Probes (no dUTP)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1863023, 1863024, or 1863025</td>
			<td>Use master mix compatible with primers/probes and ddPCR system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG32 AutoDG Cartidges</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1864108</td>
			<td>Or use material compatible with ddPCR system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet Reader</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>QX200</td>
			<td>Alternative ddPCR system may be used following manufacturer&#8217;s protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneAmp PCR Buffer</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>N8080129</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9906</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Plate Sealer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>PX1</td>
			<td>Or use material compatible with ddPCR system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet Tips for AutoDG</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1864120</td>
			<td>Or use material compatible with ddPCR system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-68 Non-ionic Surfactant</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>24040</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer and Hydrolysis Probes</td>
			<td>Various</td>
			<td>Various</td>
			<td>Design based on target sequence using general approaches for primer/probe design. Select fluorphores and quenchers compatible with ddPCR system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction Enzyme</td>
			<td>Various</td>
			<td>Various</td>
			<td>Varies with target amplification sequence. Use restriction enzyme that does not cut in the amplified sequence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheared salmon sperm DNA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9680</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic DNA gene fragment or linearized plasmid</td>
			<td>Various</td>
			<td>Various</td>
			<td>Design a synthetic DNA fragment containing the target amplification region for use as a quality control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE Buffer</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>T0224</td>
			<td>Ensure prepared or purchases nuclease free. 10 mM Tris-HCl, 1.0 mM EDTA, pH=8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Touch Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>C1000</td>
			<td>Or use material compatible with ddPCR system.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a validatable droplet digital polymerase chain reaction assay for the detection of adeno-associated viral vectors in bioshedding studies of tears

Brugen af virale vektorer til behandling af genetiske sygdomme er steget betydeligt i de senere år, med over 2.000 undersøgelser registreret til dato. Adeno-associerede virale (AAV) vektorer har fundet særlig succes i behandlingen af øjenrelaterede sygdomme, som eksemplificeret ved godkendelsen af voretigene neparvovec-rzyl. For at bringe nye terapier på markedet anmoder reguleringsagenturer typisk om kvalificerede eller validerede bioshedding-undersøgelser for at evaluere frigivelsen af vektoren i miljøet. Imidlertid er ingen officielle retningslinjer for udvikling af molekylærbaserede assays til støtte for sådanne kaste undersøgelser blevet frigivet af United States Food and Drug Administration, hvilket efterlader udviklere til at bestemme bedste praksis for sig selv. Formålet med denne protokol er at præsentere en validerelig protokol til påvisning af AAV-vektorer i humane tårer ved dråbedigital polymerasekædereaktion (ddPCR) til støtte for kliniske bioafgivelsesundersøgelser. Dette manuskript diskuterer aktuelle industrimetoder til validering af molekylært assay og demonstrerer, at metoden overstiger de kriterier for accept af målassay, der i øjeblikket foreslås i hvidbøger. Endelig diskuteres trin, der er kritiske i udførelsen af ethvert ddPCR-assay, uanset anvendelse.

Gene therapy definitions vary, but generally induce an intentional and often expected permanent alternation of a specific DNA sequence of the cellular genome to modify or manipulate the expression of a gene or to alter the biological properties of a living cell for a clinical purpose1,2. Viral vectors are increasingly being used as vehicles for gene therapy due to their efficiency of transduction, with one report suggesting that over 70% of current gene therapy clinical trials utilize viral vectors3. Interest in viral vectors for gene therapy has been gaining steadily. The Quarter 4 2022 Quarterly Data Report on the Gene, Cell, and RNA therapy landscape from the American Society of Gene and Cell Therapy reported that in 2022, the gene, cell, and RNA therapy pipeline from preclinical to pre-registration grew by 7%, bringing the total number of therapies in development to 3,726, of which 2,053 (55%) were gene therapies4. The United States Food and Drug Administration (USA FDA) currently has approved 27 cell and gene therapies for clinical use in humans, five of which specifically utilize viral vectors5.
Adeno-associated viruses (AAVs) have gained specific interest as vehicles for gene therapy. A recent meta-analysis revealed that there have been approximately 136 clinical trials investigating the use of AAVs in the past two decades6. Additionally, three of the five USA FDA approved gene therapies are AAV based. This is due to their highly editable nature, broad host range that can be tuned based on the use of specific naturally occurring or artificially engineered vectors, low pathogenicity and toxicity in humans, and generally low immunogenicity7,8. AAVs have also been successfully used to treat ocular diseases in an approved clinical setting. Voretigene neparvovec-rzyl is an AAV2-based therapy that was approved by the USA FDA in 2017 and by the European Medicines Agency (EMA) in 2018 to treat biallelic RPE65 mutation-associated retinal dystrophy9.
With increasing interest in the development of AAV-based therapies comes the need for regulatory guidance on assays. Accurate detection and quantification of any viral vector is an integral part of the discovery, manufacturing, and preclinical/clinical testing phases of product development. The USA FDA has begun to issue some guidance for gene therapies, including on the chemistry, manufacturing, and control for human gene therapy investigational new drug applications10, long-term follow-up after administration of gene therapy11, replication-competent retrovirus testing12, and recommendations for microbial vectors used in gene therapies13. The EMA has also released a series of guidelines concerning the development of gene therapy products that generally align with the FDA recommendations, though some differences do exist14. It is important to note that while these guidance do not establish legally enforceable responsibilities, except where specific regulations are referenced, they provide clarity on the current thinking from regulatory agencies on the topic and their expectations for assays required for drug filings and regulatory approval.
The FDA specifically recommends that studies should be conducted to assess the distribution, persistence, and clearance of a vector from the site of administration to target ocular and non-ocular tissues, intraocular fluids, and blood15. These take the form of biodistribution and shedding studies. Biodistribution studies evaluate exposure by investigating how a product is spread throughout a patient&#39;s body from the site of administration. Shedding specifically evaluates the release of the product from the patient into the environment and raises the possibility of transmission of the vector to untreated individuals16. The FDA makes recommendations for the design of biodistribution and shedding studies with respect to the frequency of sample collection, duration of sample collection, types of samples collected, and storage conditions.
Additionally, the FDA recommends the use of quantitative polymerase chain reaction (qPCR, or real-time PCR) for the quantitative detection of vector genomes due to its ease of performance, high-throughput format, rapid turnaround times, and assay sensitivity. However, there is a relative lack of recommendations for the design and performance assessment of molecular methods compared to those which exist for small and large molecules. Many of the guidelines for such studies are difficult to apply to molecular methods due to the unique and complex design of both the products and the assays themselves, raising questions as to the appropriateness of the available platforms for the recommended assessments and appropriate methods for assay validation. To date, the FDA has not required formal validation of PCR-based assays, though the EMA has imposed this requirement17. In light of this void, different groups and workshops have issued white papers and recommendations that manufacturers and contract research organizations have sought to follow18,19,20,21,22,23,24,25. Most of these recommendations are written specifically with qPCR assays in mind, with suggestions or alterations for emerging platforms, such as droplet digital PCR (ddPCR), included only as deemed relevant. More recent recommendations have focused on considerations for ddPCR assays, but have largely focused on their applications to vector genome quantification in a manufacturing setting rather than in the complex biological matrices encountered in bioshedding studies.
Depending on clinical application and goals, ddPCR may be preferred over qPCR in support of biodistribution and shedding studies due to ddPCR&#39;s increased sensitivity and ability to handle matrix interference compared to qPCR. Furthermore, due to the partitioning of samples into approximately 20,000 droplets, accurate quantification of the copy number can be achieved without the use of a standard curve using Poisson statistics, simplifying the method development and validation. The goal of this protocol is to describe a standardized approach for the development and validation of a ddPCR-based method for the detection of AAV vectors in tears collected from the ocular surface in support of clinical bioshedding studies.

Forfatter Spotlight: Adressering af regulatoriske huller i molekylære undersøgelser ved at kvantificere virale vektorer i komplekse matricer 

Et validerbart dråbe digitalt polymerasekædereaktionsassay til påvisning af adeno-associerede virale vektorer i bioshedding undersøgelser af tårer

Our protocol quantifies adeno-associated viral vectors in complex matrices. Accurate detection and quantification are essential to assessing their performance in clinical trials. This protocol specifically seeks to fill the current regulatory gaps in the design of good laboratory practices'compliant molecular studies.As a part of viral vector development, regulatory agencies require the assessment of vector bio-shedding. ddPCR is a promising technology for this assessment as it allows for accurate quantification without the use of a standard curve and improved sensitivity compared to qPCR. Accurate quantification in the complex matrices encountered in clinical settings, such as tears, can be challenging to validate due to PCR interference and inhibition.Limited clinical sample amounts can also limit the ability to detect rare events if the assay is not sufficiently sensitive. Our approach develops a repeatable and adaptable ddPCR-based framework to validate assays for use in regulated studies. This method avoids a specific DNA extraction step, allowing for more streamlined validation and provides clear criteria against which to evaluate assay performance to ensure robustness and repeatability.This protocol has the potential to be applied to any viral vector shedding study, not just the detection of AAV in tears, as presented here. It creates a robust and repeatable framework upon which multiple fit-for-purpose, regulated programs can be developed.

Til demonstrationsformål blev der udviklet et assay designet til at detektere en kommercielt tilgængelig, forbedret grøn fluorescerende protein (eGFP)-udtrykkende AAV2-vektor med et syntetisk dobbeltstrenget DNA-fragment indeholdende eGFP som kvalitetskontrol. I øjeblikket er der løbende debat om, hvorvidt vektoren selv eller et syntetisk DNA-fragment eller lineært plasmid er mest egnet til brug som QC. Generelt kan et syntetisk DNA-fragment eller lineært plasmid anvendes, hvis ækvivalensen med vektoren påvises ved metodeudvikling (data ikke vist). Primere og sonder blev designet og optimeret til at detektere eGFP-transgenet. Se supplerende tabel S1 for de sekvenser, der anvendes i dette arbejde. Koncentrationen af QC-fragmentstammen blev empirisk bestemt ved hjælp af ddPCR. Alle analyser blev udført ved hjælp af de koncentrationer og PCR-betingelser, der er angivet som eksempler i protokolafsnittet.
For qPCR-assays anbefales det at evaluere linearitet, følsomhed, dynamisk område, nøjagtighed og præcision af standardkurven. Da ddPCR ikke er baseret på en standardkurve til målkvantificering, skal disse anbefalinger ændres. I stedet blev QC'er bestående af syntetiske dobbeltstrengede DNA-fragmenter fortyndet til forskellige koncentrationer for at spænde over det forventede kvantificerbare område af en ddPCR-reaktion baseret på Poisson-statistisk modellering brugt 29,30,31,32 til at definere det dynamiske område og følsomhed og til at evaluere nøjagtighed og præcision. Valget af QC-koncentrationer var primært baseret på det forventede forhold mellem positive og samlede dråber i en brønd ved en given koncentration. Matematisk set er ddPCR teoretisk mest nøjagtig, når ca. 80% af partitionerne forstærker positivt. Da forholdet mellem positiv og total dråbe stiger over 0,8, falder nøjagtigheden på grund af mætning af partitionerne, idet kvantificering ikke er mulig, når 100% af dråberne er positive. I den lave ende kan teoretisk set så lidt som en positiv dråbe detekteres og kvantificeres, selvom nøjagtigheden er dårligere, og analysen er underlagt falske positive på lavt niveau. Typisk skal mindst tre dråber være positive, for at et resultat kan beregnes med 95% sikkerhed, hvilket er tærsklen for at beregne en koncentration, vi brugte her.
Der blev fremstillet en serie på fem forskellige QC-koncentrationer, hvor målkopiantallet/μL PCR-reaktionsvolumenerne blev beregnet, hvilket forventedes at give positive til samlede dråbeforhold, der spænder over det kvantificerbare interval for ddPCR, som vist i tabel 5. Disse blev brugt til at evaluere nøjagtigheden og præcisionen af analysen. I vurderingen her blev de øvre og nedre grænser for kvantificering ikke skubbet til det teoretiske maksimum, der var muligt i ddPCR. Nøjagtig kvantificering kan være mulig på højere og lavere niveauer end påvist her. Sortimentet bør udvikles i overensstemmelse med downstream-anvendelserne af denne metode.
I alt tre uafhængigt fremstillede fortyndingsserier af disse QC'er blev fremstillet i prøvefortyndingsbuffer for hver batch for at evaluere intraassaynøjagtigheden og præcisionen. Duplikerede brønde af hver QC-fortynding blev inkluderet. For at simulere en faktisk valideringsprotokol blev i alt seks nøjagtigheds- og præcisionsbatcher udført af flere analytikere over flere dage. Resultaterne fra disse seks batcher blev analyseret for at definere metodens intra-assay og inter-assay nøjagtighed og præcision og for at definere assayets dynamiske område.
Intra-assay-ydeevne blev vurderet for hver batch på hvert QC-niveau. Vi forventede, at alle QC- og NTC-brønde ville have mindst 10.000 dråber. Dette blev opfyldt i 216 ud af 216 testede brønde på tværs af alle seks batcher, med et gennemsnitligt dråbetal på 19.748 dråber / brønd (tabel 6). Dernæst forventedes inter-well %CV for hvert sæt duplikatbrønde af hver QC at være ≤25,0%, bortset fra den øvre og nedre grænse QC, hvor ≤30,0% forventedes. Dette blev opfyldt i sæt af 90 ud af 90 brønde, der blev testet på tværs af alle seks batcher for QC'erne, med en gennemsnitlig inter-well %CV på 3,9% på tværs af alle QC-niveauer (tabel 7). Alle QC'er gav gennemsnitlige positive til samlede dråbeforhold inden for de forventede intervaller, der er skitseret ovenfor (tabel 6).
Inden for hver batch blev intraassaymiddelværdien og standardafvigelsen beregnet for hvert af de uafhængigt fremstillede fortyndingsseriepunkter, og disse blev anvendt til at beregne et intraassaygennemsnit for hver koncentration i hvert assay. Dette blev brugt til at vurdere nøjagtigheden og præcisionen af analysen (tabel 8). Præcision henviser til variabiliteten i data fra replikater af den samme homogene prøve under normale analysebetingelser og evalueres ved at beregne %CV for de flere inkluderede delprøver. Vi forventede, at de tre delprøver, der blev testet inden for hver batch, ville give et intraassay %CV ≤25,0%, undtagen for den øvre og nedre grænse QC, hvor ≤30,0% forventedes. Dette blev opfyldt for alle fem QC-niveauer i hver af de 60 batches (30 ud af 30 samlede forestillinger). Generelt kunne der opnås større intra-assay-præcision end målkriterierne med en gennemsnitlig intra-assay-%CV på 7,7% på tværs af alle QC-niveauer. Nøjagtighed refererer til graden af overensstemmelse mellem den eksperimentelt bestemte værdi og den nominelle værdi. Dette evalueres ved at beregne den procentvise relative fejl (%RE eller %Bias) mellem de beregnede koncentrationer af hver QC og deres teoretisk forventede nominelle koncentrationer. Det forventedes, at gennemsnittet inden for analysen af de tre delprøver ville være ±25,0% RE af den nominelle koncentration, undtagen for den øvre og nedre grænse QC, hvor der forventedes ±30,0%. Dette blev opfyldt for alle fem QC-niveauer i hver af de 60 batches (30 ud af 30 samlede forestillinger). Generelt kunne større intra-assay-nøjagtighed end vores mål opnås med en gennemsnitlig absolut intra-assay %RE på 4,2% på tværs af alle QC-niveauer. I alle forestillinger af NTC (30 i alt) kunne der ikke påvises positive dråber.
Inter-assay nøjagtighed og præcision blev også beregnet ved hjælp af intra-assay gennemsnittet af hvert QC-niveau inden for hver batch. Inter-assay-præcisionen forventedes at være ≤25,0% CV, bortset fra den øvre og nedre grænse QC, hvor ≤30,0% forventedes. Ligeledes forventedes ±25,0% RE for nøjagtighed mellem assay, bortset fra den øvre og nedre grænse QC, hvor ±30,0% forventedes. Der blev observeret en signifikant større inter-assay-nøjagtighed og præcision end disse mål (tabel 9) med en inter-assay-præcision fra 4,0% til 8,5% og en inter-assay absolut nøjagtighed fra 1,0% til 3,2%. Samlet set viser disse resultater, at denne metode kan opnå tilstrækkelig intra- og inter-assay nøjagtighed og præcision godt inden for de nuværende industrimål. Et dynamisk område af dette assay på 2.500-2,5 kopier pr. μL PCR-reaktion kan defineres baseret på disse resultater med en samlet analysefølsomhed på 2,5 kopier pr. μL PCR-reaktion. Som tidligere nævnt kan det være muligt at validere bredere dynamiske områder.
Dernæst var det nødvendigt at evaluere analysenøjagtighed og præcision inden for målmatrixen - i dette tilfælde tårer. Assays valideres typisk forud for påbegyndelsen af kliniske undersøgelser, hvilket betyder, at tårer indsamlet fra vektorbehandlede patienter sandsynligvis ikke er tilgængelige til valideringsformål. Dette kan kunstigt skabes ved at spidse mål-AAV-vektoren i tårer indsamlet fra frivillige donorer for at skabe matrix-spikede QC'er. Samlede menneskelige tårer blev indsamlet af en tredjepart (BioIVT). Som bevis for princippet blev der anvendt en eGFP-udtrykkende AAV2-vektor erhvervet fra en kommerciel kilde. Koncentrationen af AAV2-vektorstammen blev empirisk bestemt ved hjælp af ddPCR uden brug af et DNA-isolationstrin som beskrevet i denne protokol. I hver kørsel blev AAV2 uafhængigt spiket ind i de tre tårealikvoter ved et højt (forventet 1,41 x 103 kopier/μL PCR-reaktion) og lavt (28,2 kopier/μL PCR-reaktion) niveau. Alikvoter uden tilsætning blev medtaget som kontrol for at påvise metodens specificitet.
Intra-assay-ydeevne blev vurderet for hver batch på hvert spike-niveau. Det forventedes, at alle tåreprøver ville have mindst 10.000 dråber. Dette blev opfyldt i 108 ud af 108 testede brønde på tværs af alle seks batcher, med et gennemsnitligt samlet dråbeantal på 20.208 dråber / brønd (tabel 10). Dernæst forventedes inter-well %CV for hvert sæt duplikatbrønde i hver QC at være ≤25,0% for de høje og lave spikeniveauer. Dette blev opfyldt i 36 ud af 36 sæt brønde, der blev testet på tværs af alle seks batcher for QC'erne, med en gennemsnitlig inter-well %CV på 3,2% (tabel 11).
Inden for hver batch blev intra-assay-middelværdien og standardafvigelsen beregnet for hver af de uafhængigt fremstillede tårespidser, og disse blev brugt til at beregne et intra-assay-gennemsnit for hver koncentration i hvert assay. Dette blev anvendt til at vurdere nøjagtigheden og præcisionen af analysen i matrix (tabel 12). Vi forventede, at intra-assay %CV ville være ≤25.0% og høje og lave spike niveauer. Dette blev opfyldt i seks ud af seks batches for hvert niveau. Generelt kunne der opnås større intra-assay-præcision i matrix end målet med et gennemsnitligt intra-assay %CV på 3,7% på det høje niveau og 12,2% på det lave niveau (samlet 8,0%). Det forventedes også, at intra-assayet %RE ville være ±25,0% ved begge spikeniveauer. Dette blev opfyldt i seks ud af seks batches for hvert niveau. Ligeledes blev det generelt konstateret, at større intra-assay-nøjagtighed i matrix end målet kunne opnås med en gennemsnitlig intra-assay absolut %RE på 8,1% på det lave niveau og 11,3% på det høje niveau (samlet 9,7%). For den ikke-spikede kontrol kunne der ikke påvises noget eGFP-signal i nogen af alikvoterne (tabel 12), hvilket demonstrerer metodens specificitet i den menneskelige tårematrix.
Inter-assay nøjagtighed og præcision i rivematrix blev også beregnet ved hjælp af intra-assay gennemsnittet af hvert spike niveau inden for hver batch. Det forventedes, at inter-assay-præcisionen ville være ≤25,0% CV, og for inter-assay-nøjagtighed forventede vi ±25,0% RE. Der blev observeret en signifikant større inter-assay-nøjagtighed og præcision end disse mål (tabel 13) med en inter-assay-præcision på 5,5% på det høje niveau og 7,1% på det lave niveau og med absolut inter-assay-nøjagtighed på 11,3% på det høje niveau og 8,1% på det lave niveau. Samlet set demonstrerer disse resultater nøjagtigheden, præcisionen og specificiteten af metoden i rivematrix.
Tabel 5: Kvalitetskontrol anvendt til at definere assayets dynamiske område. Forkortelser: ULQC = øvre grænse kvalitetskontrol; HQC = høj kvalitetskontrol; MQC = medium kvalitetskontrol; LQC = lav kvalitetskontrol; LLQC = kvalitetskontrol af nedre grænse NTC = ingen skabelonkontrol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65495/Longacre%20Table%205.xlsx" target="_blank">Klik her for at downloade denne tabel.</a>
Tabel 6: Samlet dråbetal og positive til samlede dråbeforhold for syntetisk dobbeltstrenget DNA-kvalitetskontrol og NTC. Forkortelser: ULQC = øvre grænse kvalitetskontrol; HQC = høj kvalitetskontrol; MQC = medium kvalitetskontrol; LQC = lav kvalitetskontrol; LLQC = kvalitetskontrol af nedre grænse NTC = ingen skabelonkontrol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65495/Longacre%20Table%206.xlsx" target="_blank">Klik her for at downloade denne tabel.</a>
Tabel 7: QC inter-well statistik (kopimål/μL PCR-reaktion). Forkortelser: ULQC = øvre grænse kvalitetskontrol; HQC = høj kvalitetskontrol; MQC = medium kvalitetskontrol; LQC = lav kvalitetskontrol; LLQC = kvalitetskontrol af nedre grænse NTC = ingen skabelonkontrol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65495/Longacre%20Table%207.xlsx" target="_blank">Klik her for at downloade denne tabel.</a>
Tabel 8: Intra-assay-nøjagtighed og præcision af QC'er (kopimål/μL PCR-reaktion). Forkortelser: ULQC = øvre grænse kvalitetskontrol; HQC = høj kvalitetskontrol; MQC = medium kvalitetskontrol; LQC = lav kvalitetskontrol; LLQC = kvalitetskontrol af nedre grænse NTC = ingen skabelonkontrol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65495/Longacre%20Table%208.xlsx" target="_blank">Klik her for at downloade denne tabel.</a>
Tabel 9: Nøjagtighed og præcision mellem analyser af QC'er (kopimål/μL PCR-reaktion). Forkortelser: ULQC = øvre grænse kvalitetskontrol; HQC = høj kvalitetskontrol; MQC = medium kvalitetskontrol; LQC = lav kvalitetskontrol; LLQC = kvalitetskontrol af nedre grænse NTC = ingen skabelonkontrol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65495/65495_Longacre%20Table%209.xlsx" target="_blank">Klik her for at downloade denne tabel.</a>
Tabel 10: Samlet antal dråber af tåreprøver. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65495/Longacre%20Table%2010.xlsx" target="_blank">Klik her for at downloade denne tabel.</a>
Tabel 11: Statistik over rivningsprøver mellem brønde (kopimål/μL PCR-reaktion). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65495/Longacre%20Table%2011.xlsx" target="_blank">Klik her for at downloade denne tabel.</a>
Tabel 12: Intra-assay nøjagtighed og præcision af tåreprøver (kopimål/μL PCR-reaktion). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65495/Longacre%20Table%2012.zip" target="_blank">Klik her for at downloade denne tabel.</a>
Tabel 13: Nøjagtighed og præcision mellem analyser af riveprøver (kopimål/μL PCR-reaktion). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65495/65495_Longacre%20Table%2013.xlsx" target="_blank">Klik her for at downloade denne tabel.</a>
Supplerende tabel S1: Sekvenser af primer, sonder og syntetisk dobbeltstrenget DNA-kvalitetskontrol anvendt i denne undersøgelse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65495/65495_Longacre%20Supp.%20Table%201.xlsx" target="_blank">Klik her for at downloade denne tabel.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Addressing Regulatory Gaps in Molecular Studies by Quantifying Viral Vectors in Complex Matrices at JoVE.com

Her præsenterer vi en protokol til udvikling og validering af god laboratoriepraksis i overensstemmelse med påvisning af adeno-associerede virale vektorer i humane tårer ved dråbe digital polymerasekædereaktion til støtte for klinisk udvikling af genterapivektorer.

The use of viral vectors to treat genetic diseases has increased substantially in recent years, with over 2,000 studies registered to date. ...

Vores protokol kvantificerer adeno-associerede virale vektorer i komplekse matricer. Nøjagtig detektion og kvantificering er afgørende for at vurdere deres ydeevne i kliniske forsøg. Denne protokol søger specifikt at udfylde de nuværende lovgivningsmæssige huller i udformningen af molekylære undersøgelser, der er i overensstemmelse med god laboratoriepraksis.Som en del af viral vektorudvikling kræver reguleringsagenturer vurdering af vektorbioafgivelse. ddPCR er en lovende teknologi til denne vurdering, da den giver mulighed for nøjagtig kvantificering uden brug af en standardkurve og forbedret følsomhed sammenlignet med qPCR. Nøjagtig kvantificering i de komplekse matricer, der opstår i kliniske omgivelser, såsom tårer, kan være udfordrende at validere på grund af PCR-interferens og hæmning.Begrænsede kliniske prøvemængder kan også begrænse evnen til at påvise sjældne hændelser, hvis analysen ikke er tilstrækkelig følsom. Vores tilgang udvikler en repeterbar og tilpasningsdygtig ddPCR-baseret ramme til validering af assays til brug i regulerede undersøgelser. Denne metode undgår et specifikt DNA-ekstraktionstrin, hvilket giver mulighed for mere strømlinet validering og giver klare kriterier for evaluering af analyseydelse for at sikre robusthed og repeterbarhed.Denne protokol har potentialet til at blive anvendt på enhver viral vektorafgivelsesundersøgelse, ikke kun påvisning af AAV i tårer, som præsenteret her. Det skaber en robust og gentagelig ramme, hvorpå flere formålstjenlige, regulerede programmer kan udvikles.

Et validerbart dråbe digitalt polymerasekædereaktionsassay til påvisning af adeno-associerede virale vektorer i bioshedding undersøgelser af tårer

Abstract