Um ensaio de reação em cadeia da polimerase digital validável em gotículas para a detecção de vetores virais adenoassociados em estudos de biosshedding de lágrimas

O uso de vetores virais para tratar doenças genéticas aumentou substancialmente nos últimos anos, com mais de 2.000 estudos registrados até o momento. Os vetores virais adenoassociados (AAV) têm encontrado particular sucesso no tratamento de doenças oculares, como exemplificado pela aprovação do voretigene neparvovec-rzyl. Para trazer novas terapias ao mercado, as agências reguladoras normalmente solicitam estudos de bioshedding qualificados ou validados para avaliar a liberação do vetor no ambiente. No entanto, nenhuma diretriz oficial para o desenvolvimento de ensaios de base molecular para apoiar tais estudos de eliminação foi divulgada pela Food and Drug Administration dos Estados Unidos, deixando os desenvolvedores para determinar as melhores práticas por si mesmos. O objetivo deste protocolo é apresentar um protocolo válido para a detecção de vetores de AAV em lágrimas humanas por reação em cadeia da polimerase digital em gotículas (ddPCR) em apoio a estudos clínicos de bioshedding. Este artigo discute as abordagens atuais da indústria para validação de ensaios moleculares e demonstra que o método excede os critérios de aceitação de ensaios alvo atualmente propostos em white papers. Finalmente, etapas críticas na realização de qualquer ensaio ddPCR, independentemente da aplicação, são discutidas.