Bio-Rad'dan Nick Russell ve Brandon McKethan'a bu yöntemin geliştirilmesi sırasındaki yararlı tartışmaları için teşekkür ederiz.

Biyodökülme Çalışmaları için ddPCR Kullanılarak Gözyaşlarındaki Viral Vektörlerin Miktarının Belirlenmesi

<ol>
	<li>Sherkow, J. S., Zettler, P. J., Greeley, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+it+'gene+therapy.">Is it 'gene therapy.</a> Journal of Law and the Biosciences. 5 (3), 786-793 (2018).</li><li>Ginn, S. L., Amaya, A. K., Alexander, I. E., Edelstein, M., Abedi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+clinical+trials+worldwide+to+2017:+an+update.">Gene therapy clinical trials worldwide to 2017: an update.</a> The Journal of Gene Medicine. 20 (5), 3015 (2018).</li><li>Ghosh, S., Brown, A. M., Jenkins, C., Campbell, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vector+systems+for+gene+therapy:+a+comprehensive+literature+review+of+progress+and+biosafety+challenges.">Viral vector systems for gene therapy: a comprehensive literature review of progress and biosafety challenges.</a> Applied Biosafety. 25 (1), 7-18 (2020).</li><li>Gene, Cell, &amp; RNA therapy landscape, Q4 2022 quarterly data report. American Society for Gene &amp; Cell Therapy Available from: <a target="_blank" href="https://asgct.org/global/documents/asgct_citeline-q4-2022-report_final.aspx">https://asgct.org/global/documents/asgct_citeline-q4-2022-report_final.aspx</a> (2022)</li><li>Approved Cellular and Gene Therapy Products. United States Food and Drug Administration Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/vaccines-blood-biologics/cellular-gene-therapy-products/approved-cellular-and-gene-therapy-products">https://www.fda.gov/vaccines-blood-biologics/cellular-gene-therapy-products/approved-cellular-and-gene-therapy-products</a> (2022)</li><li>Au, H. K. E., Isalan, M., Meilcarek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+advances:+a+meta-analysis+of+AAV+usage+in+clinical+settings.">Gene therapy advances: a meta-analysis of AAV usage in clinical settings.</a> Frontiers in Medicine. 8, 809118 (2022).</li><li>Lundstrom, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vectors+in+gene+therapy.">Viral vectors in gene therapy.</a> Diseases. 6 (2), 42 (2018).</li><li>Naso, M. F., Tomkowicz, B., Perry, W. L., Strohl, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+(AAV)+as+a+vector+for+gene+therapy.">Adeno-associated virus (AAV) as a vector for gene therapy.</a> BioDrugs. 31, 317-334 (2017).</li><li>Russell, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+voretigene+neparvovec+(AAV2-hRPE65v2)+in+patients+with+RPE65-mediated+inherited+retinal+dystrophy:+a+randomized,+controlled,+open-label,+phase+3+trial.">Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: a randomized, controlled, open-label, phase 3 trial.</a> Lancet. 390 (10097), 849-860 (2017).</li><li>Chemistry, manufacturing, and control (CMC) information for human gene therapy investigational new drugs (INDs). United States Food and Drug Administration Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/chemistry-manufacturing-and-control-cmc-information-human-gene-therapy-investigationsal-new-drug">https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/chemistry-manufacturing-and-control-cmc-information-human-gene-therapy-investigationsal-new-drug</a> (2020)</li><li>Long term follow-up after administration of human gene therapy products. United States Food and Drug Administration Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/long-term-follow-after-adminstration-human-gene-therapy-products">https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/long-term-follow-after-adminstration-human-gene-therapy-products</a> (2020)</li><li>Testing of retroviral vector-based human gene therapy products for replication competent retrovirus during product manufacture and patient follow-up. United States Food and Drug Administration Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/testing-retroviral-vector-based-human-gene-therapy-products-replication-competent-retrovirus-during">https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/testing-retroviral-vector-based-human-gene-therapy-products-replication-competent-retrovirus-during</a> (2020)</li><li>Recommendations for microbial vectors used in gene therapy. United States Food and Drug Administration Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/recommendations-microbial-vectors-used-gene-therapy">https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/recommendations-microbial-vectors-used-gene-therapy</a> (2016)</li><li>Multidisciplinary: gene therapy. European Medicines Agency Available from: <a target="_blank" href="https://www.europa.eu/en/human-regulatory-development/scientific-guidelines/multidisciplinary/multidisciplinary-gene-therapy">https://www.europa.eu/en/human-regulatory-development/scientific-guidelines/multidisciplinary/multidisciplinary-gene-therapy</a> (2023)</li><li>Human gene therapy for retinal disorders. United States Food and Drug Administration Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/human-gene-therapy-retinal-disorders">https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/human-gene-therapy-retinal-disorders</a> (2020)</li><li>Design and analysis of shedding studies for virus or bacterial-based gene therapy and oncolytic products. United States Food and Drug Administration Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/design-and-analysis-shedding-studies-virus-or-bacteria-based-gene-therapy-and-oncolytic-products">https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/design-and-analysis-shedding-studies-virus-or-bacteria-based-gene-therapy-and-oncolytic-products</a> (2015)</li><li>Guideline on the quality, non-clinical and clinical aspects of gene therapy medicinal products. European Medicines Agency Available from: <a target="_blank" href="https://www.ema.europa.eu/en/documents/scientific-guideline/guideline-quality-non-clinical-clinical-aspects-gene-therapy-medicinal-products_en.pdf">https://www.ema.europa.eu/en/documents/scientific-guideline/guideline-quality-non-clinical-clinical-aspects-gene-therapy-medicinal-products_en.pdf</a> (2018)</li><li>Kaur, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=white+paper+on+recent+issues+in+bioanalysis:+mass+spec+of+proteins,+extracellular+vesicles,+CRISPR,+chiral+assays,+oligos;+nanomedicines+bioanalysis;+ICH+M10+section+7.1;+non-liquid+&amp;+rare+matrices;+regulatory+inputs+(part+1A+-+recommendations+on+endogenous+compounds,+small+molecules,+complex+methods,+regulated+mass+spec+of+large+molecules,+small+molecule,+PoC+&amp;+part+1B+-+regulatory+agencies'+inputs+on+bioanalysis,+biomarkers,+immunogenicity,+gene+&amp;+cell+therapy+and+vaccine).">white paper on recent issues in bioanalysis: mass spec of proteins, extracellular vesicles, CRISPR, chiral assays, oligos; nanomedicines bioanalysis; ICH M10 section 7.1; non-liquid &amp; rare matrices; regulatory inputs (part 1A - recommendations on endogenous compounds, small molecules, complex methods, regulated mass spec of large molecules, small molecule, PoC &amp; part 1B - regulatory agencies' inputs on bioanalysis, biomarkers, immunogenicity, gene &amp; cell therapy and vaccine).</a> Bioanalysis. 14 (9), 505-580 (2022).</li><li>Hays, A., Islam, R., Matys, K., Williams, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Best+practices+in+qPCR+and+qPCR+validation+in+regulated+bio+analytical+laboratories.">Best practices in qPCR and qPCR validation in regulated bio analytical laboratories.</a> The AAPS Journal. 24 (2), 36 (2022).</li><li>Ma, H., Bell, K. N., Loker, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=qPCR+and+qRT-PCR+analysis:+Regulatory+points+to+consider+when+conducting+biodistribution+and+vector+shedding+studies.">qPCR and qRT-PCR analysis: Regulatory points to consider when conducting biodistribution and vector shedding studies.</a> Molecular Therapy. Methods &amp; Clinical Development. 17 (20), 152-168 (2020).</li><li>Wissel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+on+qPCR/ddPCR+assay+validation+by+GCC.">Recommendations on qPCR/ddPCR assay validation by GCC.</a> Bioanalysis. 14 (12), 853-863 (2022).</li><li>Expectations for biodistribution (BD) assessments for gene therapy (GT) products. International Pharmaceutical Regulators Programme Available from: <a target="_blank" href="https://admin.iprp.global/sites/default/files/2018-09/IPRP_GTWG_ReflectionPaper_BD_Final_2018_0713.pdf">https://admin.iprp.global/sites/default/files/2018-09/IPRP_GTWG_ReflectionPaper_BD_Final_2018_0713.pdf</a> (2018)</li><li>Pinheiro, L., Emslie, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+concepts+and+validation+of+digital+PCR+measurements.">Basic concepts and validation of digital PCR measurements.</a> Methods in Molecular Biology. 1768, 11-24 (2018).</li><li>Tzonev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamentals+of+counting+statistics+in+digital+PCR:+I+measured+two+target+copies-what+does+it+mean.">Fundamentals of counting statistics in digital PCR: I measured two target copies-what does it mean.</a> Methods in Molecular Biology. 1768, 25-43 (2018).</li><li>Prantner, A., Marr, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+concentration,+characterization,+and+integrity+analysis+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors+using+droplet+digital+PCR.">Genome concentration, characterization, and integrity analysis of recombinant adeno-associated viral vectors using droplet digital PCR.</a> PLoS One. 18, 0280242 (2023).</li><li>Primer-BLAST. National Library of Medicine, National Center for Biotechnology Information Available from: <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nim.nih.gov/tools/primer-blast/">https://www.ncbi.nim.nih.gov/tools/primer-blast/</a> (2023)</li><li>Koressaar, T., Remm, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancements+and+modifications+of+primer+design+program+Primer+3.">Enhancements and modifications of primer design program Primer 3.</a> Bioinformatics. 23 (10), 1289-1291 (2007).</li><li>Ye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer-BLAST:+A+tool+to+design+target-specific+primers+for+polymerase+chain+reaction.">Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction.</a> BMC Bioinformatics. 13, 134 (2012).</li><li>Droplet Digital PCR Application Guide. Bio-Rad Available from: <a target="_blank" href="https://www.bio-rad.com/webroot/we/pdf/lsr/literature/Bulletin_6407.pdf">https://www.bio-rad.com/webroot/we/pdf/lsr/literature/Bulletin_6407.pdf</a> (2023)</li><li>Qian, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dPCR:+A+technology+review.">dPCR: A technology review.</a> Sensors. 18 (4), 1271 (2018).</li><li>Basu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+assays+part+I:+portioning+statistics+and+digital+PCR.">Digital assays part I: portioning statistics and digital PCR.</a> SLAS Technology. 22 (4), 369-386 (2017).</li><li>Sanmiguel, J., Gao, G., Vandeberghe, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+digital+droplet-based+AAV+genome+titration.">Quantitative and digital droplet-based AAV genome titration.</a> Methods in Molecular Biology. 1950, 51-83 (2019).</li><li>Bachhuber, F., Huss, A., Senel, M., Tumani, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+biomarkers+in+tear+fluid:+from+sampling+to+preanalytical+processing.">Diagnostic biomarkers in tear fluid: from sampling to preanalytical processing.</a> Scientific Reports. 11, 10064 (2021).</li><li>Martinez-Fernandez de la Camara, C., McClements, M. E., MacLaren, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+quantification+of+AAV+vector+genomes+by+quantitative+PCR.">Accurate quantification of AAV vector genomes by quantitative PCR.</a> Genes. 12 (4), 601 (2021).</li><li>Ai, J., Ibraheim, R., Tai, P. W. L., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+scalable+and+accurate+method+for+quantifying+vector+genomes+of+recombinant+adeno-associated+viruses+in+crude+lysate.">A scalable and accurate method for quantifying vector genomes of recombinant adeno-associated viruses in crude lysate.</a> Human Gene TherapyMethods. 28 (3), 139-147 (2017).</li><li>Dobnik, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+quantification+and+characterization+of+adeno-associated+viral+vectors.">Accurate quantification and characterization of adeno-associated viral vectors.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1570 (2019).</li><li>Bennett, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+stability+as+a+determinant+of+AAV+serotype+identity.">Thermal stability as a determinant of AAV serotype identity.</a> Molecular Therapy Methods and Clinical Development. 6, 171-182 (2017).</li></ol>

Tüm yazarlar, bu protokolde açıklandığı gibi, AAV tabanlı tahlillerin desteklenmesi de dahil olmak üzere, erken keşif desteğinden ürün kaydına kadar kapsamlı İyi Laboratuvar Uygulamaları/İyi Klinik Uygulamalar uyumlu geliştirme hizmetleri sunan sözleşmeli bir araştırma kuruluşu olan KCAS Biyoanalitik ve Biyobelirteç Hizmetleri'nin çalışanlarıdır. KCAS bu projeyi ve bu protokolün yayınlanmasını finanse etti. Bu makalede sunulan deneylerin tasarımı ve doğrulanması için mevcut bir FDA kılavuzu bulunmamakla birlikte, KCAS'ta bu tür çalışmaları geliştiren uzmanlar ve düşünce liderleri bu yaklaşımı temel yaklaşım olarak benimsemişlerdir. Ek kriterler ve parametreler proje bazında tartışılır ve kullanım amacına göre dahil edilebilir.

ddPCR protokolünün, tahlilin uygun performansı için kritik olan birkaç adımı vardır. İlk kritik adım, astarların ve probun tasarımı ve optimizasyonudur. Genel olarak, hidroliz probu bazlı kimyanın boya bazlı kimya (örneğin, SYBR Green) üzerinde klinik öncesi veya klinik bir ortamda kullanılması, üstün özgüllükleri nedeniyle tavsiye edilir. Ek olarak, amplifikasyon hedefinin seçimi kritik bir konudur. Tipik olarak, vektörün ilgilendiği transgen hedeflenir. Bununla birlikte, daha erken klinik öncesi aşamalarda veya vektör transgenini genomik DNA'ya karşı ayırt etmenin mümkün olmadığı vektörlerde, standartlaştırılmış vektör hedeflerinin kullanılması uygun olabilir. Örneğin, ters çevrilmiş terminal tekrarlama bölgesini, promotörü, poli-A kuyruğunu veya bu vektör bileşenleri arasındaki segmentler arası kavşakları hedefleyebilir. Hedef seçimi vektör tasarımına göre değişecektir. Geleneksel qPCR primer ve prob tasarım stratejileri ve yazılımları genellikle ddPCR için uygundur. Gerekli optimizasyon miktarını azaltmak için tutarlı bir tavlama sıcaklığı (örneğin, 60 ° C) vermesi beklenen tasarım parametreleri seçilmelidir. Ayrıca, her hedef için en az üç farklı kümenin tasarlanması, sıralanması ve değerlendirilmesi önerilmiştir. Daha sonra en büyük özgüllüğü (negatif kontrol kuyusunda veya ilgili hedef DNA'nın matrisinde amplifikasyon yok) ve duyarlılığı (yani, algılama sınırı) gösteren küme seçilmelidir20.
Testi qPCR ve ddPCR arasında geçirebilmek avantajlıysa, önce qPCR kullanarak tahlil koşullarının optimize edilmesi ve seçilen set için R2 ≥ 0.98 ile% 90 -% 110 amplifikasyon verimliliği ile sonuçlanan koşulların belirlenmesi önerilir. Bununla birlikte, bir uç nokta yöntemi olarak ddPCR, amplifikasyon verimliliklerindeki farklılıklar nedeniyle tipik olarak qPCR'den daha az hassastır. En azından, tavlama/uzatma adımında, beklenen tavlama sıcaklıklarının üzerindeki ve altındaki sıcaklıkları kapsayacak ve negatif ve pozitif damlacık kümeleri arasındaki yağmur ve floresan genlik ayrımını sıcaklığın bir fonksiyonu olarak değerlendirmek için bir termal sıcaklık gradyanı çalıştırılması önerilir. Çalışma alanı izin veriyorsa, ana karışım hazırlama, şablon ekleme ve yükseltme için ayrı ayrı özel iş istasyonlarına sahip olmanız önerilir. Mümkün olduğunda, çapraz kontaminasyon ve yanlış pozitiflik riskini azaltmak için bunlar kontrollü erişim ve diferansiyel hava basınçları gibi yerleşik mühendislik kontrollerine sahip tek yönlü bir iş akışı ile fiziksel olarak ayrılmalıdır. Bu mümkün değilse, çapraz kontaminasyonu önlemek için çok dikkatli olunmalıdır.
Bu protokolde, qPCR testi geliştirmeye daha alışkın olanlara alışılmadık görünebilecek iki adım vardır. Birincisi, PCR ana karışımına bir kısıtlama enziminin dahil edilmesidir. ddPCR amplifikasyonu sırasında, her damlacık uç noktaya termosiklüs edilir. Düzgün bir şekilde optimize edilmiş bir tahlilde, bu, iki damlacık popülasyonu ile sonuçlanır, bir set sürekli olarak yüksek düzeyde floresan sinyalleri (pozitifler) gösterirken, diğeri sürekli olarak düşük seviyede floresan sinyali (negatifler) gösterir. PCR girişimi meydana gelirse, PCR amplifikasyonunun başlatılmasını senkronize edebilir, bu da damlacığın bir amplifikasyon platosuna ulaşmamasına ve dolayısıyla tutarsız floresan uç noktalarına neden olabilir. Bu durumda, damlacıklar negatifler ve pozitifler arasında dağılacak ve ddPCR yağmuru adı verilen bir fenomenle sonuçlanacaktır. Bu, hedefin yanlış ölçülmesine ve tutarsız ve öznel olarak uygulanan eşiklere neden olabilir. Eşiği NTC'nin sinyalinin biraz üzerine ayarlama önerimiz, tüm damlacıklar son noktaya tam olarak çevrilmemiş olsa bile, tüm damlacıklar hala pozitif olarak kabul edildiğinden, nihai nicelemede yağmurun etkilerini en aza indirgemelidir. AAV'ler, amplifikasyon hedefine bağlı olarak, primerlere ve problara erişilebilirliği azaltabilecek, PCR parazitine ve dolayısıyla yağmura neden olabilecek oldukça karmaşık bir ikincil yapıya sahiptir. Restriksiyon enziminin ana karışıma dahil edilmesi, primerlerin ve probların erişimini arttırmak için bu ikincil yapıyı ayırır, yağmuru azaltır, böylece tahlilin doğruluğunu artırabilir. ddPCR reaksiyonuna bir restriksiyon enziminin dahil edilmesinin etkileri daha önce25,32 olarak tanımlanmıştır. Herhangi bir kısıtlama enzimi, hedef amplifikasyon bölgesi içinde kesilmediği doğrulandığı sürece kullanılabilir. Ön sindirim adımlarına veya alternatif tampon bileşimlerine gerek yoktur.
İkinci olağandışı adım, AAV içeren gözyaşı örneğinin hazırlanmasıdır. Bu protokolde, 1:10 (veya daha büyük) gözyaşı oranı kullanıldı ve daha sonra numune ısıtıldı. Tipik olarak, gözyaşları yaygın olarak kullanılan bir toplama yöntemi olan kılcal bir tüp aracılığıyla toplandığında, ortalama olarak yaklaşık 10.0 μL toplanabilir33. Seyreltme, sınırlı numune hacminin ele alınmasına yardımcı olur ve yinelenen kuyu testi için yeterli malzeme sağlar. Bu, algılamanın teorik sınırını azaltırken, ddPCR'nin sağlam hassasiyeti, son derece az sayıda vektör parçacığı dışında hepsinin algılanmasıyla sonuçlanmalıdır. Bu yaklaşım ayrıca, beklenmedik bir şekilde başarısız olması durumunda bir "yedekleme" kuyusu oluşturur. Bu durumda veya iki kuyucuğu çalıştırmak için yetersiz numune hacmi durumunda, hassasiyeti değerlendirmek için Poisson hatası kullanılabilir. Ayrıca, konsantrasyonun tespit sınırının altında olduğu durumlarda, bir konsantrasyonu belirlemek için iyi verileri birleştirme fırsatı yaratır. ddPCR tespiti için AAV vektörlerinin viral kapsidlerden serbest bırakılması gerekir. AAV'nin nicelleştirilmesi için bazı yöntemler, viral kapsid34,35,36'yı çıkarmak için bir proteinaz K sindirim adımı içermektedir. Doğal olarak oluşan tüm AAV serotipleri, çoğu 80 ° C'nin altına düşen, yaklaşık 90 ° C'de veya altında erime sıcaklıklarına sahiptir; bu nedenle, bu gereksiz bir dahil etmegibi görünmektedir 37. Tek başına ısıtma, vektör DNA'sını serbest bırakmak için yeterli görünmektedir.
Ayrıca, ddPCR genellikle bir qPCR testini etkileyebilecek bir numunede bulunabilecek PCR inhibitörlerine karşı daha az hassastır. Belirli bir DNA izolasyon adımı dahil edilirse, bu aynı zamanda bu protokolde kaçınılan spesifik doğrulama gerektirir. Numuneler, vektör genomlarının bir sıvı içindeki difüzyonunun kinetiği nedeniyle ısıtmadan önce seyreltilir. Isıtma ve müteakip soğutma işlemi sırasında, tek sarmallı DNA genomunun pozitif ve negatif duyu iplikçikleri, konsantrasyonlar yeterince yüksekse, çift sarmallı bir ara ürün üretmek için birlikte tavlanabilir. Isıtmadan önce seyreltme, konsantrasyonları azaltır ve nicelemenin doğruluğu üzerinde olumsuz bir etkiye sahip olmak için yeterli çift sarmallı ara ürünlerin oluşmasını matematiksel olarak olası kılmaz. Kalite kontrol olarak kullanılan sentetik DNA fragmanlarının veya doğrusallaştırılmış plazmidlerin bu ısıtma adımından geçmemesi gerektiği unutulmamalıdır. Bunlar çift sarmallı olduğundan, ısıtma tek sarmallı ara ürünlere dönüşümle sonuçlanır. Bu tek sarmallı QC'lerin damlacıklara bağımsız olarak bölünmesinin ardından, bunun nominal konsantrasyona göre QC konsantrasyonunda iki kat artışa neden olması beklenir. Alternatif olarak, QC'ler yöntemi standartlaştırmak için ısıtılacaksa, bu, nominal bir konsantrasyonun yeniden yapılandırılması ve atanması için hesaba katılmalıdır.
Son olarak, numune hazırlama ile ilgili olarak, birçok protokol, kapsüllenmemiş vektör DNA'sını çıkarmak için bir DNaz tedavi adımının dahil edilmesini de önermektedir. Bu adım, vektör preparasyonu ile ilişkili serbest DNA'nın nicelleştirilmesinin istenmediği durumlarda kritik öneme sahiptir (dozaj amacıyla nicelleştirme sırasında olduğu gibi). Bununla birlikte, biyodağılım ve biyodökülme çalışmaları bağlamında, tipik olarak, kapsüllenmiş olup olmadığına bakılmaksızın, herhangi bir vektör DNA'sının nereye gittiğini bilmek istenir. Bu nedenle, bu tür çalışmalar sırasında tipik olarak bir DNaz tedavi adımı gerçekleştirilmemesi önerilmektedir. Bir DNaz adımının dahil edilmesinin gerekli olduğu belirlenirse, bu adım seyreltme ve ısıtmadan önce olmalıdır.
Bu yazıda, yöntemin dinamik aralığının, duyarlılığının, doğruluğunun ve hassasiyetinin amaca uygun, iyi laboratuvar uygulamalarına uygun bir doğrulama bağlamında değerlendirilmesine yönelik yaklaşımı temsil eden veriler sunulmuştur. Bu konudaki mevcut rehberlik eksikliği, mevcut endüstri düşüncesine uygun olarak, kendileri için hedef tahlil kriterlerini belirlemek için doğrulama laboratuvarlarını bırakmaktadır. Farklı gruplar bu çalışmada kullanılandan hem daha yüksek hem de daha düşük hedef kriterler ortaya koymuştur 19,20,21,22,23,24,25. Hedef tahlil kriterleri, daha katı bir şekilde tanımlanana kadar, yöntemin amaçlanan klinik uygulamalarına dayanarak validasyondan önce seçilmelidir. Verilere dayanarak verilecek aşağı akış kararlarına bağlı olarak, daha yüksek doğruluk ve hassasiyet seviyelerine ihtiyaç duyulabilir. Tersine, basit bir pozitif ve negatif sonuç yeterli olabilir.
Yaklaşım ayrıca özgüllüğün ve matris etkisinin değerlendirilmesi için önerileri de ele aldı. Tedavi edilmemiş bireylerden toplanan bir gözyaşı havuzu bu tahlilde olumlu bir sonuç veremedi, oysa vektör önerilen iyileşme oranları içinde yüksek ve düşük bir konsantrasyonda gözyaşlarına çivilendiğinde hedef tespit edilebildi. İdeal olarak, endojen vektör içeren matris (örneğin, viral vektör ile tedaviden sonra toplanan) da bu değerlendirmelere dahil edilecektir. Ancak, bu tür örneklerin bir doğrulamada kullanılmak üzere mevcut olması olası değildir. Doğrulamanın sağlamlığını arttırmak için, hastaya özgü bir matris etkisinin meydana gelip gelmediğini belirlemek için birden fazla gözyaşı havuzu veya çeşitli bireylerden toplanan gözyaşları değerlendirilebilir. Son olarak, kararlılığın değerlendirilmesi önerilir. DNA ekstraksiyonunun biyolojik matristen gerçekleştiği iş akışlarında, hem numunenin hem de ekstrakte edilen DNA'nın stabilitesini değerlendirmek gerekebilir. Bu iş akışında, numune DNA ekstraksiyonuna gerek kalmadan doğrudan tahlilde test edilir. Bu nedenle, bu yöntem için stabilitenin değerlendirilmesi göz önüne alındığında, gözyaşı örneklerinin stabilitesinin değerlendirilmesi gerekir. Tipik olarak, tezgah üstü, buzdolabı, donma/çözme ve uzun vadeli stabilite değerlendirmeleri önerilir. Bunlar bu çalışmanın bir parçası olarak gerçekleştirilmemiştir, ancak burada geliştirilen yöntemler, giriş örneklerine yapılan manipülasyonları takiben bu değerlendirmede kullanılabilir.
Genel olarak, bu yöntemin gözyaşı örneklerinde AAV tabanlı vektörleri tespit etmek için sağlam, tekrarlanabilir ve doğrulanabilir bir test olduğu gösterilmiştir. Klinik çalışmaları desteklemek için belirli vektörlere uyarlanacak bir platform görevi görebilir ve iyi laboratuvar uygulamalarıyla tutarlı bir tahlilin doğrulanması için bir temel sağlar.

Gen terapisi tanımları değişir, ancak genellikle bir genin ekspresyonunu değiştirmek veya manipüle etmek veya bir canlı hücrenin biyolojik özelliklerini klinik bir amaç için değiştirmek için hücresel genomun belirli bir DNA dizisinin kasıtlı ve sıklıkla beklenen kalıcı bir değişimini indükler 1,2. Viral vektörler, transdüksiyon etkinlikleri nedeniyle gen terapisi için giderek daha fazla araç olarak kullanılmaktadır; bir rapor, mevcut gen terapisi klinik çalışmalarının% 70'inden fazlasının viral vektörleri kullandığını göstermektedir3. Gen tedavisi için viral vektörlere olan ilgi giderek artmaktadır. Amerikan Gen ve Hücre Terapisi Derneği'nin Gen, Hücre ve RNA terapisi manzarasına ilişkin 4. Çeyrek 2022 Üç Aylık Veri Raporu, 2022 yılında, klinik öncesinden ön kayda kadar gen, hücre ve RNA terapisi boru hattının% 7 oranında arttığını ve geliştirilmekte olan toplam tedavi sayısını 3.726'ya çıkardığını ve bunların 2.053'ünün (% 55) gen terapileri olduğunu bildirmiştir4. Amerika Birleşik Devletleri Gıda ve İlaç İdaresi (ABD FDA) şu anda insanlarda klinik kullanım için 27 hücre ve gen terapisini onaylamıştır, bunlardan beşi özellikle viral vektörleri kullanmaktadır5.
Adeno ilişkili virüsler (AAV'ler) gen terapisi için araçlar olarak özel ilgi görmüştür. Yakın tarihli bir meta-analiz, son yirmi yılda AAV'lerin kullanımını araştıran yaklaşık 136 klinik çalışma olduğunu ortaya koymuştur6. Ek olarak, ABD FDA onaylı beş gen terapisinden üçü AAV tabanlıdır. Bunun nedeni, yüksek oranda düzenlenebilir doğaları, spesifik doğal olarak oluşan veya yapay olarak tasarlanmış vektörlerin kullanımına göre ayarlanabilen geniş konak aralığı, insanlarda düşük patojenite ve toksisite ve genellikle düşük immünojenite 7,8'dir. AAV'ler ayrıca onaylanmış bir klinik ortamda oküler hastalıkları tedavi etmek için başarıyla kullanılmıştır. Voretigene neparvovec-rzyl, bialelik RPE65 mutasyonuyla ilişkili retina distrofisi9'u tedavi etmek için 2017 yılında ABD FDA ve 2018 yılında Avrupa İlaç Ajansı (EMA) tarafından onaylanan AAV2 tabanlı bir tedavidir.
AAV tabanlı tedavilerin geliştirilmesine olan ilginin artmasıyla birlikte, tahliller konusunda düzenleyici rehberliğe ihtiyaç duyulmaktadır. Herhangi bir viral vektörün doğru tespiti ve miktarının belirlenmesi, ürün geliştirmenin keşif, üretim ve klinik öncesi/klinik test aşamalarının ayrılmaz bir parçasıdır. ABD FDA, insan gen terapisi için kimya, üretim ve kontrol araştırma yeni ilaç uygulamaları 10, gen terapisinin uygulanmasından sonra uzun süreli takip11, replikasyon yetkin retrovirüs testi 12 ve gen terapilerinde kullanılan mikrobiyal vektörler için öneriler13 dahil olmak üzere gen terapileri için bazı kılavuzlar yayınlamaya başlamıştır. EMA ayrıca, genel olarak FDA önerileriyle uyumlu olan gen terapisi ürünlerinin geliştirilmesine ilişkin bir dizi kılavuz yayınlamıştır, ancak bazı farklılıklar vardır14. Bu kılavuzların, belirli düzenlemelere atıfta bulunulan durumlar dışında, yasal olarak uygulanabilir sorumluluklar oluşturmamasına rağmen, düzenleyici kurumların konuyla ilgili mevcut düşünceleri ve ilaç başvuruları ve düzenleyici onay için gerekli tahliller için beklentileri hakkında netlik sağladıklarını belirtmek önemlidir.
FDA, özellikle oküler ve oküler olmayan dokuları, göz içi sıvılarını ve kanı hedeflemek için bir vektörün uygulama bölgesinden dağılımını, kalıcılığını ve klirensini değerlendirmek için çalışmaların yapılmasını önermektedir15. Bunlar biyodağılım ve dökülme çalışmaları şeklini alır. Biyodağıtım çalışmaları, bir ürünün uygulama bölgesinden hastanın vücuduna nasıl yayıldığını araştırarak maruziyeti değerlendirir. Dökülme, ürünün hastadan çevreye salınımını özel olarak değerlendirir ve vektörün tedavi edilmemiş bireylere bulaşma olasılığını artırır16. FDA, numune toplama sıklığı, numune toplama süresi, toplanan numune türleri ve depolama koşulları ile ilgili olarak biyodağılım ve dökülme çalışmalarının tasarımı için önerilerde bulunur.
Ek olarak, FDA, performans kolaylığı, yüksek verimli format, hızlı geri dönüş süreleri ve tahlil duyarlılığı nedeniyle vektör genomlarının kantitatif tespiti için kantitatif polimeraz zincir reaksiyonunun (qPCR veya gerçek zamanlı PCR) kullanılmasını önermektedir. Bununla birlikte, moleküler yöntemlerin tasarımı ve performans değerlendirmesi için küçük ve büyük moleküller için mevcut olanlara kıyasla göreceli bir öneri eksikliği vardır. Bu tür çalışmalar için kılavuzların çoğunun, hem ürünlerin hem de tahlillerin kendilerinin benzersiz ve karmaşık tasarımı nedeniyle moleküler yöntemlere uygulanması zordur, bu da önerilen değerlendirmeler için mevcut platformların uygunluğu ve tahlil doğrulaması için uygun yöntemler hakkında sorular ortaya çıkarmaktadır. Bugüne kadar, FDA, PCR tabanlı testlerin resmi olarak doğrulanmasını gerektirmemiştir, ancak EMA bu gerekliliği getirmiştir17. Bu boşluğun ışığında, farklı gruplar ve atölyeler, üreticilerin ve sözleşmeli araştırma kuruluşlarının 18,19,20,21,22,23,24,25'i takip etmeye çalıştıkları beyaz kağıtlar ve öneriler yayınladılar. Bu önerilerin çoğu, yalnızca ilgili görüldüğü şekilde dahil edilen damlacık dijital PCR (ddPCR) gibi gelişmekte olan platformlar için öneriler veya değişiklikler göz önünde bulundurularak qPCR testleri göz önünde bulundurularak yazılmıştır. Daha yeni öneriler, ddPCR testleri için dikkat edilmesi gerekenlere odaklanmıştır, ancak büyük ölçüde, biyoshedding çalışmalarında karşılaşılan karmaşık biyolojik matrislerden ziyade, bir üretim ortamında vektör genom nicelleştirmesine uygulamalarına odaklanmıştır.
Klinik uygulama ve hedeflere bağlı olarak, ddPCR'nin qPCR'ye kıyasla artan duyarlılığı ve matriks girişimlerini ele alma kabiliyeti nedeniyle biyolojik dağılım ve dökülme çalışmalarını desteklemek için ddPCR, qPCR'ye göre tercih edilebilir. Ayrıca, numunelerin yaklaşık 20.000 damlacığa bölünmesi nedeniyle, Poisson istatistikleri kullanılarak standart bir eğri kullanılmadan kopya sayısının doğru bir şekilde ölçülmesi, yöntem geliştirme ve doğrulamayı basitleştirerek elde edilebilir. Bu protokolün amacı, klinik biyodökülme çalışmalarını desteklemek amacıyla oküler yüzeyden toplanan gözyaşlarında AAV vektörlerinin saptanması için ddPCR tabanlı bir yöntemin geliştirilmesi ve doğrulanması için standartlaştırılmış bir yaklaşımı tanımlamaktır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AAV-eGFP Vector</td>
			<td>Charles River Laboratories</td>
			<td>RS-AAV2-FL</td>
			<td>Lot AAV2-0720-FL, used as a proof of principle vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoDG Droplet Digital PCR system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>QX200</td>
			<td>Alternative ddPCR system may be used following manufacturer&#8217;s protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoDG Oil for Probes</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1864110</td>
			<td>Or use material compatible with ddPCR system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Buffer Control for Probes</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1863052</td>
			<td>Or use material compatible with ddPCR system and PCR chemistry.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Droplet Reader Oil</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1863004</td>
			<td>Or use material compatible with ddPCR system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Piercable Foil Seals</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1814040</td>
			<td>Or use material compatible with ddPCR system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Plates 96-Well, Semi-Skirted</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>12001925</td>
			<td>Or use material compatible with ddPCR system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Supermix for Probes (no dUTP)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1863023, 1863024, or 1863025</td>
			<td>Use master mix compatible with primers/probes and ddPCR system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG32 AutoDG Cartidges</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1864108</td>
			<td>Or use material compatible with ddPCR system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet Reader</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>QX200</td>
			<td>Alternative ddPCR system may be used following manufacturer&#8217;s protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneAmp PCR Buffer</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>N8080129</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9906</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Plate Sealer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>PX1</td>
			<td>Or use material compatible with ddPCR system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet Tips for AutoDG</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1864120</td>
			<td>Or use material compatible with ddPCR system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-68 Non-ionic Surfactant</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>24040</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer and Hydrolysis Probes</td>
			<td>Various</td>
			<td>Various</td>
			<td>Design based on target sequence using general approaches for primer/probe design. Select fluorphores and quenchers compatible with ddPCR system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction Enzyme</td>
			<td>Various</td>
			<td>Various</td>
			<td>Varies with target amplification sequence. Use restriction enzyme that does not cut in the amplified sequence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheared salmon sperm DNA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9680</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic DNA gene fragment or linearized plasmid</td>
			<td>Various</td>
			<td>Various</td>
			<td>Design a synthetic DNA fragment containing the target amplification region for use as a quality control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE Buffer</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>T0224</td>
			<td>Ensure prepared or purchases nuclease free. 10 mM Tris-HCl, 1.0 mM EDTA, pH=8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Touch Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>C1000</td>
			<td>Or use material compatible with ddPCR system.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a validatable droplet digital polymerase chain reaction assay for the detection of adeno-associated viral vectors in bioshedding studies of tears

Genetik hastalıkları tedavi etmek için viral vektörlerin kullanımı son yıllarda önemli ölçüde artmıştır ve bugüne kadar kaydedilen 2.000'den fazla çalışma bulunmaktadır. Adeno ilişkili viral (AAV) vektörler, voretigene neparvovec-rzyl'in onaylanmasıyla örneklendiği gibi, gözle ilgili hastalıkların tedavisinde özel bir başarı elde etmişlerdir. Piyasaya yeni tedaviler getirmek için, düzenleyici kurumlar tipik olarak vektörün çevreye salınımını değerlendirmek için nitelikli veya doğrulanmış biyodökülme çalışmaları talep eder. Bununla birlikte, bu tür dökülme çalışmalarını desteklemek için moleküler tabanlı testlerin geliştirilmesi için Amerika Birleşik Devletleri Gıda ve İlaç İdaresi tarafından resmi bir kılavuz yayınlanmamıştır ve geliştiricileri kendileri için en iyi uygulamaları belirlemeye bırakmıştır. Bu protokolün amacı, klinik biyoshedding çalışmalarını desteklemek için damlacık dijital polimeraz zincir reaksiyonu (ddPCR) ile insan gözyaşlarında AAV vektörlerinin saptanması için doğrulanabilir bir protokol sunmaktır. Bu makale, moleküler tahlil validasyonuna yönelik mevcut endüstri yaklaşımlarını tartışmakta ve yöntemin şu anda beyaz kağıtlarda önerilen hedef tahlil kabul kriterlerini aştığını göstermektedir. Son olarak, uygulamadan bağımsız olarak herhangi bir ddPCR testinin performansında kritik olan adımlar tartışılmaktadır.

Gene therapy definitions vary, but generally induce an intentional and often expected permanent alternation of a specific DNA sequence of the cellular genome to modify or manipulate the expression of a gene or to alter the biological properties of a living cell for a clinical purpose1,2. Viral vectors are increasingly being used as vehicles for gene therapy due to their efficiency of transduction, with one report suggesting that over 70% of current gene therapy clinical trials utilize viral vectors3. Interest in viral vectors for gene therapy has been gaining steadily. The Quarter 4 2022 Quarterly Data Report on the Gene, Cell, and RNA therapy landscape from the American Society of Gene and Cell Therapy reported that in 2022, the gene, cell, and RNA therapy pipeline from preclinical to pre-registration grew by 7%, bringing the total number of therapies in development to 3,726, of which 2,053 (55%) were gene therapies4. The United States Food and Drug Administration (USA FDA) currently has approved 27 cell and gene therapies for clinical use in humans, five of which specifically utilize viral vectors5.
Adeno-associated viruses (AAVs) have gained specific interest as vehicles for gene therapy. A recent meta-analysis revealed that there have been approximately 136 clinical trials investigating the use of AAVs in the past two decades6. Additionally, three of the five USA FDA approved gene therapies are AAV based. This is due to their highly editable nature, broad host range that can be tuned based on the use of specific naturally occurring or artificially engineered vectors, low pathogenicity and toxicity in humans, and generally low immunogenicity7,8. AAVs have also been successfully used to treat ocular diseases in an approved clinical setting. Voretigene neparvovec-rzyl is an AAV2-based therapy that was approved by the USA FDA in 2017 and by the European Medicines Agency (EMA) in 2018 to treat biallelic RPE65 mutation-associated retinal dystrophy9.
With increasing interest in the development of AAV-based therapies comes the need for regulatory guidance on assays. Accurate detection and quantification of any viral vector is an integral part of the discovery, manufacturing, and preclinical/clinical testing phases of product development. The USA FDA has begun to issue some guidance for gene therapies, including on the chemistry, manufacturing, and control for human gene therapy investigational new drug applications10, long-term follow-up after administration of gene therapy11, replication-competent retrovirus testing12, and recommendations for microbial vectors used in gene therapies13. The EMA has also released a series of guidelines concerning the development of gene therapy products that generally align with the FDA recommendations, though some differences do exist14. It is important to note that while these guidance do not establish legally enforceable responsibilities, except where specific regulations are referenced, they provide clarity on the current thinking from regulatory agencies on the topic and their expectations for assays required for drug filings and regulatory approval.
The FDA specifically recommends that studies should be conducted to assess the distribution, persistence, and clearance of a vector from the site of administration to target ocular and non-ocular tissues, intraocular fluids, and blood15. These take the form of biodistribution and shedding studies. Biodistribution studies evaluate exposure by investigating how a product is spread throughout a patient&#39;s body from the site of administration. Shedding specifically evaluates the release of the product from the patient into the environment and raises the possibility of transmission of the vector to untreated individuals16. The FDA makes recommendations for the design of biodistribution and shedding studies with respect to the frequency of sample collection, duration of sample collection, types of samples collected, and storage conditions.
Additionally, the FDA recommends the use of quantitative polymerase chain reaction (qPCR, or real-time PCR) for the quantitative detection of vector genomes due to its ease of performance, high-throughput format, rapid turnaround times, and assay sensitivity. However, there is a relative lack of recommendations for the design and performance assessment of molecular methods compared to those which exist for small and large molecules. Many of the guidelines for such studies are difficult to apply to molecular methods due to the unique and complex design of both the products and the assays themselves, raising questions as to the appropriateness of the available platforms for the recommended assessments and appropriate methods for assay validation. To date, the FDA has not required formal validation of PCR-based assays, though the EMA has imposed this requirement17. In light of this void, different groups and workshops have issued white papers and recommendations that manufacturers and contract research organizations have sought to follow18,19,20,21,22,23,24,25. Most of these recommendations are written specifically with qPCR assays in mind, with suggestions or alterations for emerging platforms, such as droplet digital PCR (ddPCR), included only as deemed relevant. More recent recommendations have focused on considerations for ddPCR assays, but have largely focused on their applications to vector genome quantification in a manufacturing setting rather than in the complex biological matrices encountered in bioshedding studies.
Depending on clinical application and goals, ddPCR may be preferred over qPCR in support of biodistribution and shedding studies due to ddPCR&#39;s increased sensitivity and ability to handle matrix interference compared to qPCR. Furthermore, due to the partitioning of samples into approximately 20,000 droplets, accurate quantification of the copy number can be achieved without the use of a standard curve using Poisson statistics, simplifying the method development and validation. The goal of this protocol is to describe a standardized approach for the development and validation of a ddPCR-based method for the detection of AAV vectors in tears collected from the ocular surface in support of clinical bioshedding studies.

Yazar Gündemi: Karmaşık Matrislerde Viral Vektörleri Ölçerek Moleküler Çalışmalardaki Düzenleyici Boşlukları Ele Alma 

Gözyaşlarının Biyodökülme Çalışmalarında Adeno-İlişkili Viral Vektörlerin Tespiti için Doğrulanabilir Bir Damlacık Dijital Polimeraz Zincir Reaksiyonu Testi

Our protocol quantifies adeno-associated viral vectors in complex matrices. Accurate detection and quantification are essential to assessing their performance in clinical trials. This protocol specifically seeks to fill the current regulatory gaps in the design of good laboratory practices'compliant molecular studies.As a part of viral vector development, regulatory agencies require the assessment of vector bio-shedding. ddPCR is a promising technology for this assessment as it allows for accurate quantification without the use of a standard curve and improved sensitivity compared to qPCR. Accurate quantification in the complex matrices encountered in clinical settings, such as tears, can be challenging to validate due to PCR interference and inhibition.Limited clinical sample amounts can also limit the ability to detect rare events if the assay is not sufficiently sensitive. Our approach develops a repeatable and adaptable ddPCR-based framework to validate assays for use in regulated studies. This method avoids a specific DNA extraction step, allowing for more streamlined validation and provides clear criteria against which to evaluate assay performance to ensure robustness and repeatability.This protocol has the potential to be applied to any viral vector shedding study, not just the detection of AAV in tears, as presented here. It creates a robust and repeatable framework upon which multiple fit-for-purpose, regulated programs can be developed.

Gösterim amacıyla, ticari olarak temin edilebilen, geliştirilmiş yeşil floresan proteini (eGFP) eksprese eden AAV2 vektörünü tespit etmek için tasarlanmış, kalite kontrol olarak eGFP içeren sentetik bir çift sarmallı DNA fragmanı ile tasarlanmış bir tahlil geliştirilmiştir. Şu anda, vektörün kendisinin mi yoksa sentetik bir DNA fragmanının veya doğrusallaştırılmış plazmidin QC olarak kullanım için en uygun olup olmadığı konusunda devam eden tartışmalar vardır. Genel olarak, yöntem geliştirmede vektöre eşdeğerlik gösteriliyorsa sentetik bir DNA fragmanı veya doğrusallaştırılmış plazmid kullanılabilir (veriler gösterilmemiştir). Astarlar ve problar, eGFP transgenini tespit etmek için tasarlanmış ve optimize edilmiştir. Bu çalışmada kullanılan diziler için Ek Tablo S1'e bakın. QC fragman stoğunun konsantrasyonu ddPCR kullanılarak ampirik olarak belirlendi. Tüm tahliller protokol bölümünde örnek olarak verilen konsantrasyonlar ve PCR koşulları kullanılarak yapıldı.
qPCR testleri için, standart eğrinin doğrusallığını, hassasiyetini, dinamik aralığını, doğruluğunu ve hassasiyetini değerlendirmeniz önerilir. ddPCR, hedef niceleme için standart bir eğriye dayanmadığından, bu öneriler değiştirilmelidir. Bunun yerine, Poisson istatistiksel modellemesine dayanan bir ddPCR reaksiyonunun beklenen ölçülebilir aralığını kapsayacak şekilde çeşitli konsantrasyonlara seyreltilmiş sentetik çift sarmallı DNA parçalarından oluşan QC'ler, dinamik aralığı ve duyarlılığı tanımlamak ve doğruluğu ve hassasiyeti değerlendirmek için 29,30,31,32 kullanılmıştır. QC konsantrasyonlarının seçimi, öncelikle belirli bir konsantrasyondaki bir kuyu içindeki pozitifin toplam damlacıklara beklenen oranına dayanıyordu. Matematiksel olarak, ddPCR, bölümlerin yaklaşık% 80'i pozitif olarak çoğaldığında teorik olarak en doğrudur. Pozitif-toplam damlacık oranı 0.8'in üzerine çıktıkça, bölümlerin doygunluğu nedeniyle doğruluk azalır, damlacıkların% 100'ü pozitif olduğunda nicelleştirme mümkün değildir. Düşük uçta, teorik olarak, bir pozitif damlacık kadar az tespit edilebilir ve nicelleştirilebilir, ancak doğruluk daha zayıftır ve tahlil düşük seviyeli yanlış pozitiflere tabidir. Tipik olarak, bir sonucun %95 güvenle hesaplanması için en az üç damlacık pozitif olmalıdır, bu da burada kullandığımız bir konsantrasyonu hesaplamak için eşiktir.
Beş farklı QC konsantrasyonundan oluşan bir dizi hazırlandı ve hesaplanan hedef kopya sayısı / μL PCR reaksiyon hacimlerinin, Tablo 5'te gösterildiği gibi, ölçülebilir ddPCR aralığını kapsayan toplam damlacık oranlarına pozitif çıkması bekleniyordu. Bunlar, tahlilin doğruluğunu ve hassasiyetini değerlendirmek için kullanıldı. Buradaki değerlendirmede, nicelemenin üst ve alt sınırları ddPCR'de mümkün olan teorik maksimuma itilmemiştir. Doğru niceleme, burada gösterilenden daha yüksek ve daha düşük seviyelerde mümkün olabilir. Aralık, bu yöntemin çıkış yönündeki uygulamalarla uyumlu olarak geliştirilmelidir.
Bu QC'lerin toplam üç bağımsız olarak hazırlanmış seyreltme serisi, tahlil içi doğruluğu ve hassasiyeti değerlendirmek için her parti için numune seyreltme tamponunda hazırlanmıştır. Her QC seyreltmesinin yinelenen kuyuları dahil edildi. Gerçek bir doğrulama protokolünü simüle etmek için, birden fazla analist tarafından birkaç gün boyunca toplam altı doğruluk ve hassasiyet partisi gerçekleştirildi. Bu altı partiden elde edilen sonuçlar, yöntemin tahlil içi ve tahliller arası doğruluğunu ve hassasiyetini tanımlamak ve tahlilin dinamik aralığını tanımlamak için analiz edilmiştir.
Her QC seviyesindeki her parti için tahlil içi performans değerlendirildi. Tüm QC ve NTC kuyularının en az 10.000 damlacık içermesini bekliyorduk. Bu, altı partinin tamamında test edilen 216 kuyudan 216'sında, ortalama damlacık sayısı 19.748 damlacık / kuyu ile karşılandı (Tablo 6). Daha sonra, her bir QC'nin her bir yinelenen kuyu kümesinin kuyular arası %CV'sinin, %≤30,0'ın beklendiği üst ve alt sınır QC hariç, %≤25,0 olması bekleniyordu. Bu, QC'ler için altı partinin tamamında test edilen 90 kuyudan 90'ından oluşan setlerde karşılandı ve tüm QC seviyelerinde ortalama% 3.9'luk bir kuyular arası CV ile karşılandı (Tablo 7). Tüm QC'ler, yukarıda özetlenen beklenen aralıklarda toplam damlacık oranlarına ortalama pozitif sonuç vermiştir (Tablo 6).
Her parti içinde, bağımsız olarak hazırlanan seyreltme serisi noktalarının her biri için tahlil içi ortalama ve standart sapma hesaplandı ve bunlar, her tahlildeki her konsantrasyon için bir tahlil içi ortalamayı hesaplamak için kullanıldı. Bu, tahlilin doğruluğunu ve hassasiyetini değerlendirmek için kullanılmıştır (Tablo 8). Hassasiyet, normal tahlil koşulları altında aynı homojen numunenin replikalarından elde edilen verilerdeki değişkenliği ifade eder ve çoklu dahil edilen alikotların %CV'si hesaplanarak değerlendirilir. Her partide test edilen üç alikotun, %30,0'ın beklendiği üst ve alt sınır QC hariç, tahlil içi %CV ≤≤ %25,0 vermesini bekledik. Bu, 60 partinin her birinde beş QC seviyesinin tümü için karşılandı (toplam 30 performanstan 30'u). Genel olarak, hedef kriterlerden daha fazla tahlil içi hassasiyet elde edilebilir, tüm QC seviyelerinde ortalama tahlil içi %7,7 CV ile. Doğruluk, deneysel olarak belirlenen değer ile nominal değer arasındaki anlaşmanın yakınlığını ifade eder. Bu, her bir QC'nin hesaplanan konsantrasyonları ile teorik olarak beklenen nominal konsantrasyonları arasındaki göreceli hata yüzdesinin (%RE veya %Bias) hesaplanmasıyla değerlendirilir. Üç alikotun tahlil içi ortalamasının, %±30.0'ının beklendiği üst ve alt sınır QC hariç, nominal konsantrasyonun %±25.0 RE'si olması bekleniyordu. Bu, 60 partinin her birinde beş QC seviyesinin tümü için karşılandı (toplam 30 performanstan 30'u). Genel olarak, tüm QC seviyelerinde ortalama mutlak tahlil içi %4,2 RE ile hedefimizden daha fazla tahlil içi doğruluk elde edilebilir. NTC'nin tüm performanslarında (toplam 30), pozitif damlacıklar tespit edilemedi.
Tahliller arası doğruluk ve hassasiyet, her parti içindeki her QC seviyesinin tahlil içi ortalaması kullanılarak da hesaplanmıştır. Tahliller arası hassasiyetin, %30,0 beklenen üst ve alt sınır QC hariç, %≤≤25,0 CV olması bekleniyordu. Benzer şekilde, tahliller arası doğruluk için±,% 30.0'ın beklendiği üst ve alt sınır QC hariç,% 25.0 RE ± bekleniyordu. Bu hedeflerden önemli ölçüde daha yüksek bir tahlil doğruluğu ve hassasiyeti gözlenmiştir (Tablo 9), tahliller arası hassasiyet %4,0 ila %8,5 arasında değişmekte ve tahliller arası mutlak doğruluk %1,0 ila %3,2 arasında değişmektedir. Toplu olarak, bu sonuçlar, bu yöntemin mevcut endüstri hedefleri dahilinde yeterli tahlil içi ve tahlil doğruluğu ve hassasiyeti elde edebileceğini göstermektedir. Bu tahlilin PCR reaksiyonunun μL başına 2.500-2.5 kopyalık dinamik bir aralığı, bu sonuçlara dayanarak, PCR reaksiyonunun μL başına 2.5 kopyalık bir genel tahlil duyarlılığı ile tanımlanabilir. Daha önce de belirtildiği gibi, daha geniş dinamik aralıkları doğrulamak mümkün olabilir.
Daha sonra, hedef matris içindeki tahlil doğruluğunu ve hassasiyetini değerlendirmek gerekiyordu - bu durumda gözyaşları. Tipik olarak, tahliller klinik çalışmaların başlatılmasından önce doğrulanır, yani vektörle tedavi edilen hastalardan toplanan gözyaşlarının doğrulama amacıyla mevcut olması muhtemel değildir. Bu, hedef AAV vektörünü, matris çivili QC'ler oluşturmak için gönüllü bağışçılardan toplanan gözyaşlarına sokarak yapay olarak oluşturulabilir. İlke kanıtı için, ticari bir kaynaktan elde edilen eGFP eksprese eden bir AAV2 vektörü kullanılmıştır. AAV2 vektör stoğunun konsantrasyonu, bu protokolde açıklandığı gibi, bir DNA izolasyon adımı kullanılmadan, ddPCR kullanılarak ampirik olarak belirlendi. Her çalışmada, AAV2 bağımsız olarak yüksek (beklenen 1.41 x 103 kopya / μL PCR reaksiyonu) ve düşük (28.2 kopya / μL PCR reaksiyonu) seviyesinde üç gözyaşı alikotuna çivilendi. Çivili olmayan alikotlar, yöntemin özgüllüğünü göstermek için bir kontrol olarak dahil edildi.
Her parti için her ani artış seviyesinde tahlil içi performans değerlendirildi. Tüm gözyaşı örneklerinin en az 10.000 damlacık içermesi bekleniyordu. Bu, altı partinin tamamında test edilen 108 kuyudan 108'inde karşılandı ve ortalama toplam damlacık sayısı 20.208 damlacık / kuyu idi (Tablo 10). Daha sonra, her bir QC'nin her bir yinelenen kuyu setinin kuyular arası %CV'sinin, yüksek ve düşük başak seviyeleri için% ≤25.0 olması bekleniyordu. Bu, QC'ler için altı partinin tamamında test edilen 36 kuyu setinden 36'sında, ortalama kuyular arası %3,2 CV ile karşılanmıştır (Tablo 11).
Her parti içinde, bağımsız olarak hazırlanan gözyaşı sivri uçlarının her biri için tahlil içi ortalama ve standart sapma hesaplandı ve bunlar, her tahlildeki her konsantrasyon için bir tahlil içi ortalamayı hesaplamak için kullanıldı. Bu, matristeki tahlilin doğruluğunu ve hassasiyetini değerlendirmek için kullanılmıştır (Tablo 12). Tahlil içi %CV'nin %≤25.0 ve yüksek ve düşük spike seviyeleri olmasını bekledik. Bu, her seviye için altı partiden altısında karşılandı. Genel olarak, matriste hedeften daha fazla tahlil içi hassasiyet elde edilebilir, ortalama tahlil içi %3,7 CV yüksek seviyede %3,7 ve düşük seviyede %12,2 (genel olarak %8,0). Ayrıca, tahlil içi %RE'nin her iki ani yükseliş seviyesinde de %±25.0 olması bekleniyordu. Bu, her seviye için altı partiden altısında karşılandı. Benzer şekilde, genel olarak, matriste hedeften daha fazla tahlil içi doğruluğun elde edilebildiği, ortalama tahlil içi mutlak %RE'nin düşük seviyede %8,1 ve yüksek seviyede %11,3 (genel olarak %9,7) olduğu bulunmuştur. Çivilenmemiş kontrol için, alikotların hiçbirinde (Tablo 12) hiçbir eGFP sinyali tespit edilememiştir, bu da insan gözyaşı matrisindeki yöntemin özgüllüğünü göstermektedir.
Gözyaşı matrisindeki tahliller arası doğruluk ve hassasiyet, her bir partideki her bir başak seviyesinin tahlil içi ortalaması kullanılarak da hesaplanmıştır. Tahliller arası hassasiyetin %≤25.0 CV olması bekleniyordu ve tahliller arası doğruluk için %25.0 RE ± bekliyorduk. Bu hedeflerden önemli ölçüde daha yüksek bir tahlil doğruluğu ve hassasiyeti gözlenmiştir (Tablo 13), yüksek seviyede %5,5 ve düşük seviyede %7,1'lik bir tahliller arası hassasiyet ve yüksek seviyede %11,3 ve düşük seviyede %8,1'lik mutlak tahliller arası doğruluk ile. Toplu olarak, bu sonuçlar gözyaşı matrisindeki yöntemin doğruluğunu, hassasiyetini ve özgüllüğünü göstermektedir.
Tablo 5: Tahlilin dinamik aralığını tanımlamak için kullanılan kalite kontrolleri. Kısaltmalar: ULQC = üst sınır kalite kontrol; HQC = yüksek kalite kontrol; MQC = orta kalite kontrol; LQC = düşük kalite kontrol; LLQC = alt limit kalite kontrol; NTC = şablon denetimi yok. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65495/Longacre%20Table%205.xlsx" target="_blank">Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Tablo 6: Toplam damlacık sayıları ve sentetik çift sarmallı DNA kalite kontrolü ve NTC'nin pozitif-toplam damlacık oranları. Kısaltmalar: ULQC = üst sınır kalite kontrol; HQC = yüksek kalite kontrol; MQC = orta kalite kontrol; LQC = düşük kalite kontrol; LLQC = alt limit kalite kontrol; NTC = şablon denetimi yok. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65495/Longacre%20Table%206.xlsx" target="_blank">Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Tablo 7: QC kuyular arası istatistikler (kopyalama hedefleri/μL PCR reaksiyonu). Kısaltmalar: ULQC = üst sınır kalite kontrol; HQC = yüksek kalite kontrol; MQC = orta kalite kontrol; LQC = düşük kalite kontrol; LLQC = alt limit kalite kontrol; NTC = şablon denetimi yok. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65495/Longacre%20Table%207.xlsx" target="_blank">Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Tablo 8: QC'lerin tahlil içi doğruluğu ve hassasiyeti (kopyalama hedefleri/μL PCR reaksiyonu). Kısaltmalar: ULQC = üst sınır kalite kontrol; HQC = yüksek kalite kontrol; MQC = orta kalite kontrol; LQC = düşük kalite kontrol; LLQC = alt limit kalite kontrol; NTC = şablon denetimi yok. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65495/Longacre%20Table%208.xlsx" target="_blank">Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Tablo 9: QC'lerin tahliller arası doğruluğu ve hassasiyeti (kopyalama hedefleri/μL PCR reaksiyonu). Kısaltmalar: ULQC = üst sınır kalite kontrol; HQC = yüksek kalite kontrol; MQC = orta kalite kontrol; LQC = düşük kalite kontrol; LLQC = alt limit kalite kontrol; NTC = şablon denetimi yok. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65495/65495_Longacre%20Table%209.xlsx" target="_blank">Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Tablo 10: Gözyaşı örneklerinin toplam damlacık sayıları. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65495/Longacre%20Table%2010.xlsx" target="_blank">Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Tablo 11: Gözyaşı örneği kuyular arası istatistikler (kopyalama hedefleri/μL PCR reaksiyonu). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65495/Longacre%20Table%2011.xlsx" target="_blank">Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Tablo 12: Gözyaşı numunelerinin tahlil içi doğruluğu ve hassasiyeti (kopyalama hedefleri/μL PCR reaksiyonu). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65495/Longacre%20Table%2012.zip" target="_blank">Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Tablo 13: Gözyaşı numunelerinin tahliller arası doğruluğu ve hassasiyeti (kopyalama hedefleri/μL PCR reaksiyonu). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65495/65495_Longacre%20Table%2013.xlsx" target="_blank">Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Ek Tablo S1: Bu çalışmada kullanılan primer, problar ve sentetik çift sarmallı DNA kalite kontrol dizileri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65495/65495_Longacre%20Supp.%20Table%201.xlsx" target="_blank">Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Addressing Regulatory Gaps in Molecular Studies by Quantifying Viral Vectors in Complex Matrices at JoVE.com

Burada, gen tedavisi vektörlerinin klinik gelişimini desteklemek için damlacık dijital polimeraz zincir reaksiyonu ile insan gözyaşlarında adeno ilişkili viral vektörlerin uyumlu tespitinde iyi laboratuvar uygulamalarının geliştirilmesi ve doğrulanması için bir protokol sunuyoruz.

The use of viral vectors to treat genetic diseases has increased substantially in recent years, with over 2,000 studies registered to date. ...

Protokolümüz, karmaşık matrislerdeki adeno ilişkili viral vektörleri nicelleştirir. Doğru tespit ve niceliklendirme, klinik çalışmalardaki performanslarını değerlendirmek için esastır. Bu protokol özellikle iyi laboratuvar uygulamalarının uyumlu moleküler çalışmalarının tasarımındaki mevcut düzenleyici boşlukları doldurmayı amaçlamaktadır.Viral vektör gelişiminin bir parçası olarak, düzenleyici kurumlar vektör biyo-dökülmesinin değerlendirilmesini gerektirir. ddPCR, standart bir eğri kullanmadan doğru nicelemeye ve qPCR'ye kıyasla gelişmiş hassasiyete izin verdiği için bu değerlendirme için umut verici bir teknolojidir. Gözyaşları gibi klinik ortamlarda karşılaşılan karmaşık matrislerde doğru nicelleştirme, PCR girişimi ve inhibisyonu nedeniyle doğrulanması zor olabilir.Sınırlı klinik numune miktarları, tahlil yeterince hassas değilse, nadir olayları tespit etme yeteneğini de sınırlayabilir. Yaklaşımımız, düzenlenmiş çalışmalarda kullanılmak üzere tahlilleri doğrulamak için tekrarlanabilir ve uyarlanabilir ddPCR tabanlı bir çerçeve geliştirir. Bu yöntem, belirli bir DNA ekstraksiyon adımından kaçınarak daha akıcı doğrulamaya izin verir ve sağlamlık ve tekrarlanabilirliği sağlamak için tahlil performansını değerlendirmek için net kriterler sağlar.Bu protokol, burada sunulduğu gibi, sadece gözyaşlarında AAV'nin tespitine değil, herhangi bir viral vektör dökülme çalışmasına uygulanma potansiyeline sahiptir. Birden fazla amaca uygun, düzenlenmiş programın geliştirilebileceği sağlam ve tekrarlanabilir bir çerçeve oluşturur.

Gözyaşlarının Biyodökülme Çalışmalarında Adeno-İlişkili Viral Vektörlerin Tespiti için Doğrulanabilir Bir Damlacık Dijital Polimeraz Zincir Reaksiyonu Testi

Abstract