A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Методы встраивания реакций синтеза внеклеточных белков в гидрогели макромасштаба
In This Article
Summary
В данной работе мы представляем два протокола для встраивания внеклеточных реакций синтеза белка в макромасштабные гидрогелевые матрицы без необходимости использования внешней жидкой фазы.
Abstract
Синтетические генные сети предоставляют ученым и инженерам платформу для проектирования и создания новых систем с функциональностью, закодированной на генетическом уровне. В то время как доминирующей парадигмой развертывания генных сетей является клеточное шасси, синтетические генные сети также могут быть развернуты в бесклеточной среде. Многообещающие области применения внеклеточных генных сетей включают биосенсоры, поскольку эти устройства были продемонстрированы против биотических (вирусы Эбола, Зика и SARS-CoV-2) и абиотических (тяжелые металлы, сульфиды, пестициды и другие органические загрязнители) мишеней. Бесклеточные системы, как правило, развертываются в жидкой форме в реакционном сосуде. Однако возможность встраивания таких реакций в физическую матрицу может способствовать их более широкому применению в более широком наборе сред. С этой целью разработаны методы встраивания реакций бесклеточного синтеза белка (CFPS) в различные гидрогелевые матрицы. Одним из ключевых свойств гидрогелей, способствующих этой работе, является высокая водовосстанавливающая способность гидрогелевых материалов. Кроме того, гидрогели обладают физическими и химическими характеристиками, которые являются функционально полезными. Гидрогели можно сублимировать для хранения и регидратировать для последующего использования. Представлены два пошаговых протокола включения и анализа реакций CFPS в гидрогелях. Во-первых, система CFPS может быть включена в гидрогель путем регидратации клеточным лизатом. Затем система внутри гидрогеля может быть индуцирована или экспрессирована конститутивно для полной экспрессии белка через гидрогель. Во-вторых, клеточный лизат может быть введен в гидрогель в точке полимеризации, а вся система может быть сублимирована и регидратирована в более поздней точке с помощью водного раствора, содержащего индуктор для системы экспрессии, закодированной в гидрогеле. Эти методы потенциально позволяют создавать бесклеточные генные сети, которые наделяют гидрогелевые материалы сенсорными способностями, с потенциалом использования за пределами лаборатории.
Introduction
Синтетическая биология объединяет различные инженерные дисциплины для проектирования и конструирования биологически обоснованных деталей, устройств и систем, которые могут выполнять функции, не встречающиеся в природе. Большинство подходов синтетической биологии по-прежнему привязаны к живым клеткам. В отличие от них, бесклеточные системы синтетической биологии обеспечивают беспрецедентный уровень контроля и свободы в проектировании, обеспечивая большую гибкость и сокращение времени для разработки биологических систем, устраняя при этом многие ограничения, присущие традиционным методам клеточной экспрессии генов 1,2,3
Protocol
1. Клеточный лизатный буфер и подготовка среды
- Приготовление 2х YT+P агара и среды
- Приготовьте 2x YT+P агар, отмерив 16 г/л триптона, 10 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л NaCl, 40 мл/л 1 М К 2 HPO 4, 22 мл/л 1 М KH2PO4 и 15 г/л агара. Для бульона 2x YT+P следуйте предыдущему соста.......
Representative Results
В этом протоколе подробно описаны два метода встраивания реакций CFPS в гидрогелевые матрицы, а на рисунке 1 представлен схематический обзор этих двух подходов. Оба способа поддаются сублимационной сушке и длительному хранению. Метод А является наиболее используемой мет.......
Discussion
Здесь описаны два протокола для включения реакций CFPS на основе лизата клеток E. coli в агарозные гидрогели. Эти методы позволяют обеспечить одновременную экспрессию генов по всему материалу. Протокол может быть адаптирован для других систем CFPS и был успешно проведен с коммерчески до.......
Acknowledgements
Авторы выражают глубокую признательность Научно-исследовательскому совету по биотехнологии и биологическим наукам за поддержку наград BB/V017551/1 (S.K., T.P.H.) и BB/W01095X/1 (A.L., T.P.H.), а также Исследовательского совета по инженерным и физическим наукам - Оборонные научно-технические лаборатории EP/N026683/1 (C.J.W., A.M.B., T.P.H.). Данные, подтверждающие данную публикацию, находятся в открытом доступе по адресу: 10.25405/data.ncl.22232452. В целях открытого доступа автор применил лицензию Creative Commons Attribution (CC BY) к любой версии рукописи, принятой автором.
....Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| 3-PGA | Santa Cruz Biotechnology | sc-214793B | |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Agar | Thermo Fisher Scientific | A10752.22 | |
| Agarose | Severn Biotech | 30-15-50 | |
| Amino Acid Sampler Kit | VWR | BTRABR1401801 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A8937-1G | |
| cAMP | Sigma-Aldrich | A9501-1G | |
| Coenzyme A (CoA) | Sigma-Aldrich | C4282-100MG | |
| CTP | Alfa Aesar | J14121.MC | |
| DTT | Thermo Fisher Scientific | R0862 | |
| Folinic Acid | Sigma-Aldrich | F7878-100MG | |
| GTP | Carbosynth | NG01208 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-25G | |
| K-glutamate | Sigma-Aldrich | G1149-100G | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876-1G | |
| Mg-glutamate | Sigma-Aldrich | 49605-250G | |
| NAD | Sigma-Aldrich | N6522-250MG | |
| PEG-8000 | Promega | V3011 | |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 757551-5G | |
| Potassium Phosphate Dibasic (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | P3786-500G | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | RDD037-500G | |
| Protease Inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P2714-1BTL | |
| Qubit Protein concentration kit | Thermo Fisher Scientific | A50668 | |
| Rossetta 2 DE 3 E.coli | Sigma-Aldrich | 71397-3 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888-500G | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | 85558-1G | |
| Tryptone | Thermo Fisher Scientific | 211705 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | GE17-1321-01 | |
| tRNA | Sigma-Aldrich | 10109541001 | |
| UTP | Alfa Aesar | J23160.MC | |
| Yeast Extract | Sigma-Aldrich | Y1625-1KG | |
| Equipment | |||
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | HS4323-500EA | |
| 10K MWCO dialysis cassettes | Thermo Fisher Scientific | 66381 | |
| 15 mL centrifuge tube | Sarstedt | 62.554.502 | |
| 50 mL centrifuge bottles | Sarstedt | 62.547.254 | |
| 500 mL centrifuge bottles | Thermo Fisher Scientific | 3120-9500 | |
| Alpha 1-2 LD Plus freeze-dryer | Christ | part no. 101521, 101522, 101527 | |
| Benchtop Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | H-X3R | |
| Black 384 well microtitre plates | Fischer Scientific | 66 | |
| Cuvettes | Thermo Fisher Scientific | 222S | |
| Elga Purelab Chorus | Elga | ##### | |
| Eppendorf Microcentrifuge 5425R | Eppendorf | EP00532 | |
| High Speed Centrifuge | Beckman Coulter | B34183 | |
| JMP license | SAS Institute | 15 | |
| Magnetic Stirrer | Fischer Scientific | 15353518 | |
| Parafilm | Amcor | PM-966 | |
| Photospectrometer (Biophotometer) | Eppendorf | 16713 | |
| Pipettes and tips | Gilson | ##### | |
| Precision Balance | Sartorius | 16384738 | |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q32866 | |
| Shaking Incubator | Thermo Fisher Scientific | SHKE8000 | |
| Sonic Dismembrator (Sonicator) | Thermo Fisher Scientific | 12893543 | |
| Static Incubator | Sanyo | MIR-162 | |
| Syringe and needles | Thermo Fisher Scientific | 66490 | |
| Thermo max Q8000 (Shaking Incubator) | Thermo Fisher Scientific | SHKE8000 | |
| Varioskan Lux platereader | Thermo Fisher Scientific | VLBL00GD1 | |
| Vortex Genie 2 | Cole-parmer | OU-04724-05 | |
| VWR PHenomenal pH 1100 L, ph/mv/°c meter | VWR | 662-1657 |
References
- Lu, Y. Cell-free synthetic biology: Engineering in an open world. Synthetic and System Biotechnology. 2 (1), 23-27 (2017).
- Perez, J. G., Stark, J. C., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: Engineering beyond the cell.
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved