Методы встраивания реакций синтеза внеклеточных белков в гидрогели макромасштаба

Summary

В данной работе мы представляем два протокола для встраивания внеклеточных реакций синтеза белка в макромасштабные гидрогелевые матрицы без необходимости использования внешней жидкой фазы.

Abstract

Синтетические генные сети предоставляют ученым и инженерам платформу для проектирования и создания новых систем с функциональностью, закодированной на генетическом уровне. В то время как доминирующей парадигмой развертывания генных сетей является клеточное шасси, синтетические генные сети также могут быть развернуты в бесклеточной среде. Многообещающие области применения внеклеточных генных сетей включают биосенсоры, поскольку эти устройства были продемонстрированы против биотических (вирусы Эбола, Зика и SARS-CoV-2) и абиотических (тяжелые металлы, сульфиды, пестициды и другие органические загрязнители) мишеней. Бесклеточные системы, как правило, развертываются в жидкой форме в реакционном сосуде. Однако возможность встраивания таких реакций в физическую матрицу может способствовать их более широкому применению в более широком наборе сред. С этой целью разработаны методы встраивания реакций бесклеточного синтеза белка (CFPS) в различные гидрогелевые матрицы. Одним из ключевых свойств гидрогелей, способствующих этой работе, является высокая водовосстанавливающая способность гидрогелевых материалов. Кроме того, гидрогели обладают физическими и химическими характеристиками, которые являются функционально полезными. Гидрогели можно сублимировать для хранения и регидратировать для последующего использования. Представлены два пошаговых протокола включения и анализа реакций CFPS в гидрогелях. Во-первых, система CFPS может быть включена в гидрогель путем регидратации клеточным лизатом. Затем система внутри гидрогеля может быть индуцирована или экспрессирована конститутивно для полной экспрессии белка через гидрогель. Во-вторых, клеточный лизат может быть введен в гидрогель в точке полимеризации, а вся система может быть сублимирована и регидратирована в более поздней точке с помощью водного раствора, содержащего индуктор для системы экспрессии, закодированной в гидрогеле. Эти методы потенциально позволяют создавать бесклеточные генные сети, которые наделяют гидрогелевые материалы сенсорными способностями, с потенциалом использования за пределами лаборатории.

Introduction

Синтетическая биология объединяет различные инженерные дисциплины для проектирования и конструирования биологически обоснованных деталей, устройств и систем, которые могут выполнять функции, не встречающиеся в природе. Большинство подходов синтетической биологии по-прежнему привязаны к живым клеткам. В отличие от них, бесклеточные системы синтетической биологии обеспечивают беспрецедентный уровень контроля и свободы в проектировании, обеспечивая большую гибкость и сокращение времени для разработки биологических систем, устраняя при этом многие ограничения, присущие традиционным методам клеточной экспрессии генов ^1,2,3

Protocol

1. Клеточный лизатный буфер и подготовка среды

1. Приготовление 2х YT+P агара и среды
   1. Приготовьте 2x YT+P агар, отмерив 16 г/л триптона, 10 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л NaCl, 40 мл/л 1 М К 2 HPO 4, 22 мл/л 1 М KH₂PO₄ и 15 г/л агара. Для бульона 2x YT+P следуйте предыдущему соста.......

Discussion

Здесь описаны два протокола для включения реакций CFPS на основе лизата клеток E. coli в агарозные гидрогели. Эти методы позволяют обеспечить одновременную экспрессию генов по всему материалу. Протокол может быть адаптирован для других систем CFPS и был успешно проведен с коммерчески до.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material
3-PGA	Santa Cruz Biotechnology	sc-214793B
Acetic Acid	Sigma-Aldrich	A6283
Agar	Thermo Fisher Scientific	A10752.22
Agarose	Severn Biotech	30-15-50
Amino Acid Sampler Kit	VWR	BTRABR1401801
ATP	Sigma-Aldrich	A8937-1G
cAMP	Sigma-Aldrich	A9501-1G
Coenzyme A (CoA)	Sigma-Aldrich	C4282-100MG
CTP	Alfa Aesar	J14121.MC
DTT	Thermo Fisher Scientific	R0862
Folinic Acid	Sigma-Aldrich	F7878-100MG
GTP	Carbosynth	NG01208
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034-25G
K-glutamate	Sigma-Aldrich	G1149-100G
Lysozyme	Sigma-Aldrich	L6876-1G
Mg-glutamate	Sigma-Aldrich	49605-250G
NAD	Sigma-Aldrich	N6522-250MG
PEG-8000	Promega	V3011
Potassium Hydroxide (KOH)	Sigma-Aldrich	757551-5G
Potassium Phosphate Dibasic (K2HPO4)	Sigma-Aldrich	P3786-500G
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	RDD037-500G
Protease Inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	P2714-1BTL
Qubit Protein concentration kit	Thermo Fisher Scientific	A50668
Rossetta 2 DE 3 E.coli	Sigma-Aldrich	71397-3
Sodium Chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S9888-500G
Spermidine	Sigma-Aldrich	85558-1G
Tryptone	Thermo Fisher Scientific	211705
Tris	Sigma-Aldrich	GE17-1321-01
tRNA	Sigma-Aldrich	10109541001
UTP	Alfa Aesar	J23160.MC
Yeast Extract	Sigma-Aldrich	Y1625-1KG
Equipment
1.5 mL microcentrifuge tubes	Sigma-Aldrich	HS4323-500EA
10K MWCO dialysis cassettes	Thermo Fisher Scientific	66381
15 mL centrifuge tube	Sarstedt	62.554.502
50 mL centrifuge bottles	Sarstedt	62.547.254
500 mL centrifuge bottles	Thermo Fisher Scientific	3120-9500
Alpha 1-2 LD Plus freeze-dryer	Christ	part no. 101521, 101522, 101527
Benchtop Centrifuge	Thermo Fisher Scientific	H-X3R
Black 384 well microtitre plates	Fischer Scientific	66
Cuvettes	Thermo Fisher Scientific	222S
Elga Purelab Chorus	Elga	#####
Eppendorf Microcentrifuge 5425R	Eppendorf	EP00532
High Speed Centrifuge	Beckman Coulter	B34183
JMP license	SAS Institute	15
Magnetic Stirrer	Fischer Scientific	15353518
Parafilm	Amcor	PM-966
Photospectrometer (Biophotometer)	Eppendorf	16713
Pipettes and tips	Gilson	#####
Precision Balance	Sartorius	16384738
Qubit 2.0 Fluorometer	Thermo Fisher Scientific	Q32866
Shaking Incubator	Thermo Fisher Scientific	SHKE8000
Sonic Dismembrator (Sonicator)	Thermo Fisher Scientific	12893543
Static Incubator	Sanyo	MIR-162
Syringe and needles	Thermo Fisher Scientific	66490
Thermo max Q8000 (Shaking Incubator)	Thermo Fisher Scientific	SHKE8000
Varioskan Lux platereader	Thermo Fisher Scientific	VLBL00GD1
Vortex Genie 2	Cole-parmer	OU-04724-05
VWR PHenomenal pH 1100 L, ph/mv/°c meter	VWR	662-1657