Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

В данной работе мы представляем два протокола для встраивания внеклеточных реакций синтеза белка в макромасштабные гидрогелевые матрицы без необходимости использования внешней жидкой фазы.

Abstract

Синтетические генные сети предоставляют ученым и инженерам платформу для проектирования и создания новых систем с функциональностью, закодированной на генетическом уровне. В то время как доминирующей парадигмой развертывания генных сетей является клеточное шасси, синтетические генные сети также могут быть развернуты в бесклеточной среде. Многообещающие области применения внеклеточных генных сетей включают биосенсоры, поскольку эти устройства были продемонстрированы против биотических (вирусы Эбола, Зика и SARS-CoV-2) и абиотических (тяжелые металлы, сульфиды, пестициды и другие органические загрязнители) мишеней. Бесклеточные системы, как правило, развертываются в жидкой форме в реакционном сосуде. Однако возможность встраивания таких реакций в физическую матрицу может способствовать их более широкому применению в более широком наборе сред. С этой целью разработаны методы встраивания реакций бесклеточного синтеза белка (CFPS) в различные гидрогелевые матрицы. Одним из ключевых свойств гидрогелей, способствующих этой работе, является высокая водовосстанавливающая способность гидрогелевых материалов. Кроме того, гидрогели обладают физическими и химическими характеристиками, которые являются функционально полезными. Гидрогели можно сублимировать для хранения и регидратировать для последующего использования. Представлены два пошаговых протокола включения и анализа реакций CFPS в гидрогелях. Во-первых, система CFPS может быть включена в гидрогель путем регидратации клеточным лизатом. Затем система внутри гидрогеля может быть индуцирована или экспрессирована конститутивно для полной экспрессии белка через гидрогель. Во-вторых, клеточный лизат может быть введен в гидрогель в точке полимеризации, а вся система может быть сублимирована и регидратирована в более поздней точке с помощью водного раствора, содержащего индуктор для системы экспрессии, закодированной в гидрогеле. Эти методы потенциально позволяют создавать бесклеточные генные сети, которые наделяют гидрогелевые материалы сенсорными способностями, с потенциалом использования за пределами лаборатории.

Introduction

Синтетическая биология объединяет различные инженерные дисциплины для проектирования и конструирования биологически обоснованных деталей, устройств и систем, которые могут выполнять функции, не встречающиеся в природе. Большинство подходов синтетической биологии по-прежнему привязаны к живым клеткам. В отличие от них, бесклеточные системы синтетической биологии обеспечивают беспрецедентный уровень контроля и свободы в проектировании, обеспечивая большую гибкость и сокращение времени для разработки биологических систем, устраняя при этом многие ограничения, присущие традиционным методам клеточной экспрессии генов 1,2,3

Protocol

1. Клеточный лизатный буфер и подготовка среды

  1. Приготовление 2х YT+P агара и среды
    1. Приготовьте 2x YT+P агар, отмерив 16 г/л триптона, 10 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л NaCl, 40 мл/л 1 М К 2 HPO 4, 22 мл/л 1 М KH2PO4 и 15 г/л агара. Для бульона 2x YT+P следуйте предыдущему соста.......

Representative Results

В этом протоколе подробно описаны два метода встраивания реакций CFPS в гидрогелевые матрицы, а на рисунке 1 представлен схематический обзор этих двух подходов. Оба способа поддаются сублимационной сушке и длительному хранению. Метод А является наиболее используемой мет.......

Discussion

Здесь описаны два протокола для включения реакций CFPS на основе лизата клеток E. coli в агарозные гидрогели. Эти методы позволяют обеспечить одновременную экспрессию генов по всему материалу. Протокол может быть адаптирован для других систем CFPS и был успешно проведен с коммерчески до.......

Acknowledgements

Авторы выражают глубокую признательность Научно-исследовательскому совету по биотехнологии и биологическим наукам за поддержку наград BB/V017551/1 (S.K., T.P.H.) и BB/W01095X/1 (A.L., T.P.H.), а также Исследовательского совета по инженерным и физическим наукам - Оборонные научно-технические лаборатории EP/N026683/1 (C.J.W., A.M.B., T.P.H.). Данные, подтверждающие данную публикацию, находятся в открытом доступе по адресу: 10.25405/data.ncl.22232452. В целях открытого доступа автор применил лицензию Creative Commons Attribution (CC BY) к любой версии рукописи, принятой автором.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Material
3-PGASanta Cruz Biotechnologysc-214793B
Acetic AcidSigma-AldrichA6283
AgarThermo Fisher ScientificA10752.22
AgaroseSevern Biotech30-15-50
Amino Acid Sampler KitVWRBTRABR1401801
ATPSigma-AldrichA8937-1G
cAMPSigma-AldrichA9501-1G
Coenzyme A (CoA)Sigma-AldrichC4282-100MG
CTPAlfa AesarJ14121.MC
DTTThermo Fisher ScientificR0862
Folinic AcidSigma-AldrichF7878-100MG
GTPCarbosynthNG01208
HEPESSigma-AldrichH4034-25G
K-glutamateSigma-AldrichG1149-100G
LysozymeSigma-AldrichL6876-1G
Mg-glutamateSigma-Aldrich49605-250G
NADSigma-AldrichN6522-250MG
PEG-8000PromegaV3011
Potassium Hydroxide (KOH)Sigma-Aldrich757551-5G
Potassium Phosphate Dibasic (K2HPO4)Sigma-AldrichP3786-500G
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4)Sigma-AldrichRDD037-500G
Protease Inhibitor cocktailSigma-AldrichP2714-1BTL
Qubit Protein concentration kitThermo Fisher ScientificA50668
Rossetta 2 DE 3 E.coliSigma-Aldrich71397-3
Sodium Chloride (NaCl)Sigma-AldrichS9888-500G
SpermidineSigma-Aldrich85558-1G
TryptoneThermo Fisher Scientific211705
TrisSigma-AldrichGE17-1321-01
tRNASigma-Aldrich10109541001
UTPAlfa AesarJ23160.MC
Yeast ExtractSigma-AldrichY1625-1KG
Equipment
1.5 mL microcentrifuge tubesSigma-AldrichHS4323-500EA
10K MWCO dialysis cassettesThermo Fisher Scientific66381
15 mL centrifuge tubeSarstedt62.554.502
50 mL centrifuge bottlesSarstedt62.547.254
500 mL centrifuge bottlesThermo Fisher Scientific3120-9500
Alpha 1-2 LD Plus freeze-dryerChristpart no. 101521, 101522, 101527
Benchtop CentrifugeThermo Fisher ScientificH-X3R
Black 384 well microtitre platesFischer Scientific66
CuvettesThermo Fisher Scientific222S
Elga Purelab ChorusElga#####
Eppendorf Microcentrifuge 5425REppendorfEP00532
High Speed CentrifugeBeckman CoulterB34183
JMP licenseSAS Institute15
Magnetic StirrerFischer Scientific15353518
ParafilmAmcorPM-966
Photospectrometer (Biophotometer)Eppendorf16713
Pipettes and tipsGilson#####
Precision BalanceSartorius16384738
Qubit 2.0 FluorometerThermo Fisher ScientificQ32866
Shaking IncubatorThermo Fisher ScientificSHKE8000
Sonic Dismembrator (Sonicator)Thermo Fisher Scientific12893543
Static IncubatorSanyoMIR-162
Syringe and needlesThermo Fisher Scientific66490
Thermo max Q8000 (Shaking Incubator)Thermo Fisher ScientificSHKE8000
Varioskan Lux platereaderThermo Fisher ScientificVLBL00GD1
Vortex Genie 2Cole-parmerOU-04724-05
VWR PHenomenal pH 1100 L, ph/mv/°c meterVWR662-1657

References

  1. Lu, Y. Cell-free synthetic biology: Engineering in an open world. Synthetic and System Biotechnology. 2 (1), 23-27 (2017).
  2. Perez, J. G., Stark, J. C., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: Engineering beyond the cell.

Explore More Articles

196CFPS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved