Методы встраивания реакций синтеза внеклеточных белков в гидрогели макромасштаба

В данной работе мы представляем два протокола для встраивания внеклеточных реакций синтеза белка в макромасштабные гидрогелевые матрицы без необходимости использования внешней жидкой фазы.

Синтетические генные сети предоставляют ученым и инженерам платформу для проектирования и создания новых систем с функциональностью, закодированной на генетическом уровне. В то время как доминирующей парадигмой развертывания генных сетей является клеточное шасси, синтетические генные сети также могут быть развернуты в бесклеточной среде. Многообещающие области применения внеклеточных генных сетей включают биосенсоры, поскольку эти устройства были продемонстрированы против биотических (вирусы Эбола, Зика и SARS-CoV-2) и абиотических (тяжелые металлы, сульфиды, пестициды и другие органические загрязнители) мишеней. Бесклеточные системы, как правило, развертываются в жидкой форме в реакционном сосуде. Однако возможность встраивания таких реакций в физическую матрицу может способствовать их более широкому применению в более широком наборе сред. С этой целью разработаны методы встраивания реакций бесклеточного синтеза белка (CFPS) в различные гидрогелевые матрицы. Одним из ключевых свойств гидрогелей, способствующих этой работе, является высокая водовосстанавливающая способность гидрогелевых материалов. Кроме того, гидрогели обладают физическими и химическими характеристиками, которые являются функционально полезными. Гидрогели можно сублимировать для хранения и регидратировать для последующего использования. Представлены два пошаговых протокола включения и анализа реакций CFPS в гидрогелях. Во-первых, система CFPS может быть включена в гидрогель путем регидратации клеточным лизатом. Затем система внутри гидрогеля может быть индуцирована или экспрессирована конститутивно для полной экспрессии белка через гидрогель. Во-вторых, клеточный лизат может быть введен в гидрогель в точке полимеризации, а вся система может быть сублимирована и регидратирована в более поздней точке с помощью водного раствора, содержащего индуктор для системы экспрессии, закодированной в гидрогеле. Эти методы потенциально позволяют создавать бесклеточные генные сети, которые наделяют гидрогелевые материалы сенсорными способностями, с потенциалом использования за пределами лаборатории.

Синтетическая биология объединяет различные инженерные дисциплины для проектирования и конструирования биологически обоснованных деталей, устройств и систем, которые могут выполнять функции, не встречающиеся в природе. Большинство подходов синтетической биологии по-прежнему привязаны к живым клеткам. В отличие от них, бесклеточные системы синтетической биологии обеспечивают беспрецедентный уровень контроля и свободы в проектировании, обеспечивая большую гибкость и сокращение времени для разработки биологических систем, устраняя при этом многие ограничения, присущие традиционным методам клеточной экспрессии генов ^1,2,3

1. Клеточный лизатный буфер и подготовка среды

1. Приготовление 2х YT+P агара и среды
   1. Приготовьте 2x YT+P агар, отмерив 16 г/л триптона, 10 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л NaCl, 40 мл/л 1 М К 2 HPO 4, 22 мл/л 1 М KH₂PO₄ и 15 г/л агара. Для бульона 2x YT+P следуйте предыдущему соста.......

В этом протоколе подробно описаны два метода встраивания реакций CFPS в гидрогелевые матрицы, а на рисунке 1 представлен схематический обзор этих двух подходов. Оба способа поддаются сублимационной сушке и длительному хранению. Метод А является наиболее используемой мет.......

Здесь описаны два протокола для включения реакций CFPS на основе лизата клеток E. coli в агарозные гидрогели. Эти методы позволяют обеспечить одновременную экспрессию генов по всему материалу. Протокол может быть адаптирован для других систем CFPS и был успешно проведен с коммерчески до.......

Авторы выражают глубокую признательность Научно-исследовательскому совету по биотехнологии и биологическим наукам за поддержку наград BB/V017551/1 (S.K., T.P.H.) и BB/W01095X/1 (A.L., T.P.H.), а также Исследовательского совета по инженерным и физическим наукам - Оборонные научно-технические лаборатории EP/N026683/1 (C.J.W., A.M.B., T.P.H.). Данные, подтверждающие данную публикацию, находятся в открытом доступе по адресу: 10.25405/data.ncl.22232452. В целях открытого доступа автор применил лицензию Creative Commons Attribution (CC BY) к любой версии рукописи, принятой автором.