As doenças oculares degenerativas que afetam a camada do epitélio pigmentado da retina do olho têm origem monogênica e poligênica. Vários modelos de doença e um software, LipidUNet, foram desenvolvidos para estudar mecanismos de doença, bem como potenciais intervenções terapêuticas.
O epitélio pigmentado da retina (EPR) é uma monocamada de células hexagonais localizada na parte posterior do olho. Fornece nutrição e suporte a fotorreceptores e capilares coroidais, realiza fagocitose de segmentos externos (POS) fotorreceptores e secreta citocinas de forma polarizada para manter a homeostase da retina externa. A EPR disfuncional, causada por mutações, envelhecimento e fatores ambientais, resulta na degeneração de outras camadas da retina e causa perda da visão. Uma característica fenotípica marcante da degeneração do EPR são os depósitos ricos em lipídios intra e subcelulares. Esses depósitos são um fenótipo comum em diferentes doenças degenerativas da retina. Para reproduzir in vitro o fenótipo de depósito lipídico das degenerações retinianas monogênicas, o EPR derivado de células-tronco pluripotentes induzido (iRPE) foi gerado a partir de fibroblastos dos pacientes. Linhagens celulares geradas a partir de pacientes com doença de Stargardt e degeneração retiniana de início tardio (L-ORD) foram alimentadas com POS por 7 dias para replicar a função fisiológica do EPR, que causou patologia induzida por fagocitose POS nessas doenças. Para gerar um modelo para a degeneração macular relacionada à idade (DMRI), uma doença poligênica associada à ativação alternativa do complemento, a iRPE foi desafiada com anafilatoxinas alternativas do complemento. Os depósitos lipídicos intra e subcelulares foram caracterizados utilizando-se Vermelho do Nilo, boro-dipirrometeno (BODIPY) e apolipoproteína E (APOE). Para quantificar a densidade dos depósitos lipídicos, foi desenvolvido um software baseado em aprendizado de máquina, o LipidUNet. O software foi treinado em imagens de projeção de máxima intensidade de iRPE em superfícies de cultura. No futuro, será treinado para analisar imagens tridimensionais (3D) e quantificar o volume de gotículas lipídicas. O software LipidUNet será um recurso valioso para a descoberta de fármacos que diminuam o acúmulo lipídico em modelos de doenças.
O epitélio pigmentado da retina (EPR) é uma monocamada de células localizada na parte posterior do olho adjacente aos fotorreceptores da retina. O EPR desempenha um papel vital na manutenção da visão adequada, fornecendo suporte metabólico e estrutural aos fotorreceptores. As células saudáveis do EPR são caracterizadas por uma morfologia hexagonal distinta. Eles são conectados por tight junctions, que permitem que o PSE atue como uma barreira entre os coriocapilares localizados em sua face basal e os fotorreceptores localizados apicamente. Para manter o ecossistema da retina, o EPR transporta metabólitos-chave, por exemplo, glicose, para fotorreceptores de forma a minimizar o consumo de glicose no EPR1. Devido a essa limitação, o EPR depende de outros metabólitos para manter suas necessidades metabólicas, incluindo os ácidos graxos, que o EPR converte em cetonas por meio da β-oxidação2. Dada a propensão do EPR a utilizar ácidos graxos, que provavelmente são reciclados da digestão do segmento externo (SOP) dos fotorreceptores, como fonte de energia, alterações prejudiciais nas vias de processamento lipídico no EPR frequentemente levam ou estão implicadas em doenças degenerativas retinianas monogênicas e poligênicas3.
A degeneração macular relacionada à idade (DMRI), uma doença ocular degenerativa poligênica que causa degeneração do EPR, também tem sido associada à autofagia aberrante e ao metabolismo lipídico na monocamada do EPR. A falha de uma monocamada disfuncional de EPR em processar a SOP e executar outras funções críticas leva a depósitos extracelulares (sub-PSE) chamados depósitos lineares basais (BLinD) localizados entre o EPR e a membrana de Bruch - uma característica das patologias da DMRI. Os principais componentes da LBinD incluem as lipoproteínas, sendo a apolipoproteína E (APOE) a mais abundante4. O acúmulo de finas camadas de LBinD pode levar a drusas moles, o que é reconhecido como sintoma clínico da DMRI 5,6.
Vários grupos têm demonstrado que modelos de doenças in vitro derivadas de células-tronco que causam disfunção do EPR apresentam acúmulo lipídico sub-EPR 7,8,9. (2017) geraram EPR pluripotente induzido derivado de células-tronco (iRPE) de pacientes com alto risco de DMRI devido a um polimorfismo do gene CFH. A iPSE apresentou acúmulo de drusa, como marcado pela APOE, e a PSE de alto risco acumulou depósitos maiores do que a iRPE gerada em pacientes de baixo risco10.
Para criar um modelo in vitro que recapitule as características celulares da DMRI, como gotículas lipídicas e deposição de drusas, linhagens de iRPE geradas a partir de amostras de sangue de pacientes foram estabelecidas usando um protocolo guiado pelo desenvolvimento previamente publicado11. Os iRPE foram submetidos ao soro humano competente para o complemento (CC-HS), uma solução contendo anafilatoxinas que mimetizam uma possível causa de DMRI: aumento da sinalização alternativa do complemento8. A deposição celular e subcelular resultante dos depósitos lipídicos foi medida usando marcadores lipídicos e lipoprotéicos comumente usados, APOE, Nile Red e BODIPY. Por meio desses marcadores, demonstrou-se que a sinalização ativada do complemento via CC-HS exacerbou o acúmulo lipídico nas células iRPE8.
Para desenvolver um modelo de doença para uma doença degenerativa retiniana monogênica, linhagens de iRPE foram desenvolvidas a partir de pacientes com doença de Stargardt, uma doença causada por mutações no gene ABCA4 em EPR. Foi demonstrado anteriormente que, quando o ABCA4 é nocauteado, a lipofuscina A2E, um depósito intracelular conhecido por conter altos níveis de fosfolipídios e produtos de peroxidação lipídica dependentes de luz, se acumula dentro do EPR12. Linhagens knockout ABCA4 foram desenvolvidas ao lado das linhagens dos pacientes, e ambas foram submetidas à alimentação por PDV. O Stargardt iRPE demonstrou patologia induzida por fagocitose POS, exibindo aumento do acúmulo lipídico quantificado pela coloração BODIPY. PSE derivados de iPSCs ABCA4 KO foram submetidos ao tratamento CC-HS; a quantificação do sinal BODIPY também mostrou defeito no manuseio lipídico no modelo da doença de Stargardt9.
Dada a prevalência dessas doenças e a necessidade de terapêuticas eficazes, juntamente com os modelos de doenças relevantes descritos acima, há necessidade de estabelecer métodos robustos para quantificar a eficácia de potenciais tratamentos. Para quantificar os depósitos lipídicos de forma objetiva, automatizada e padronizada, um software baseado em aprendizado de máquina, LipidUNet, foi criado para que, quando emparelhado com ferramentas de análise de máscaras, a deposição lipídica possa ser rápida e efetivamente identificada usando os marcadores comuns Nile Red, BODIPY e APOE. As estatísticas resumidas obtidas usando este pipeline de análise podem então ser analisadas e exibidas graficamente, permitindo uma fácil comparação das condições de tratamento. O esquema do protocolo é mostrado na Figura 1.
Figura 1: Esquema do protocolo: As células do EPR são cultivadas em uma placa de 96 poços e desafiadas com soro humano ativo ou segmentos externos bovinos purificados para modelar diferentes tipos de degenerações retinianas in vitro. As células do EPR são fixadas e coradas para depósitos de lipoproteínas com Vermelho do Nilo, BODIPY e APOE. Um microscópio confocal é usado para adquirir pilhas Z de partículas lipídicas fluorescentemente marcadas, que são subsequentemente processadas em projeções de intensidade máxima 2D. Um algoritmo de aprendizado de máquina foi treinado para reconhecer e segmentar corretamente as partículas de lipoproteínas. Tabelas de resumo contendo contagem de partículas e várias métricas de forma são geradas e podem ser usadas para plotagem subsequente e análise estatística. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Todas as etapas do protocolo seguem as diretrizes estabelecidas pelo comitê de ética em pesquisa humana do NIH. O trabalho com células-tronco e a coleta de amostras de pacientes foram aprovados pelo Combined NeuroScience Institutional Review Board (CNS IRB) sob o Office of Human Research Protection (OHRP), NIH, de acordo com as diretrizes 45 CFR 46 do governo dos EUA. As amostras dos pacientes foram coletadas por meio do termo de consentimento livre e esclarecido aprovado pelo CNS de acordo com os critérios estabelecidos pela Declaração de Helsinque sob o número de protocolo NCT01432847 (https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01432847?cond=NCT01432847&draw=2&rank=1).
1. Geração de iRPE
Figura 2: Esquema de diferenciação e maturação do iRPE. Para gerar a iRPE, um protocolo de diferenciação estabelecido foi seguido, e as células foram deixadas amadurecer por 5 semanas. A cultura celular resultante atua como um modelo in vitro que pode ser manipulado com vários tratamentos para mimetizar a disfunção do EPR em doenças como DMRI e doença de Stargardt. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Imagens representativas da diferenciação e maturação bem-sucedidas e malsucedidas da PSE. Duas imagens de campo brilhante com aumento de 10x da PSE TJP1 são mostradas no Dia 42 do protocolo iRPE. (A) A diferenciação e maturação bem-sucedidas mostrarão PSE confluente com pigmentação e morfologia poligonal. (B) A diferenciação e a maturação malsucedidas mostrarão aglomerados de células moribundas, como mostrado aqui. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
2. Preparação do meio de manutenção RPE (RPE-MM)
3. Semeadura de placa de 96 poços
4. Modelos de doenças in vitro
5. Coloração para depósitos sub-RPE
6. Automação e processamento de imagens
7. Segmentação e quantificação
NOTA: O programa LipidUNet foi treinado em imagens de 40x de uma placa de 96 poços. É altamente recomendável o uso de imagens obtidas com objetiva de 40x.
Figura 4: Interface do usuário do LipidUNet. O software LipidUNet possui diferentes seções para selecionar para o diretório de dados de treinamento, onde as imagens dos depósitos lipídicos foram identificadas corretamente; o diretório de pesos do modelo, que é produzido a partir dos dados de treinamento; e o diretório de dados de previsão no qual o usuário inserirá suas imagens para segmentação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Este protocolo fornece um fluxo de trabalho para identificar depósitos lipídicos corados por Nile Red, BODIPY e APOE. O software desenvolvido pode identificar e quantificar automaticamente os depósitos lipídicos e tem melhor desempenho quando o protocolo delineado é otimizado. Incluem-se exemplos de PSE diferenciado com sucesso (Figura 3A) e EPR pouco diferenciado (Figura 3B), pois a qualidade do modelo celular impacta sobremaneira a qualidade da segmentação adequada da imagem.
Dois dos três marcadores descritos no protocolo, Nile Red e BODIPY, são identificados como pequenos pontos circulares que são nitidamente brilhantes nas imagens fluorescentes (Figura 5 e Figura 6). Uma imagem "positiva" do protocolo seria uma identificação apropriada desses depósitos distintos (Figura 5A-D e Figura 5E-H). Um resultado "negativo" mostraria segmentação incorreta da imagem ao confundir fluorescência de fundo com depósito, seja pela fraca coloração (Figura 6A-C e Figura 6D-F) ou pela alta intensidade de fundo (Figura 6G-I).
Os depósitos de APOE têm uma variedade de tamanhos e formas, parecendo mais ovais ou irregulares do que os depósitos circulares de Nile Red e BODIPY. Esses depósitos também são menos pontuais, e a intensidade de sinal pode diferir entre os depósitos devido a variações na permeabilização da amostra. A identificação correta identificará cada depósito, incluindo aqueles que estão menos saturados (Figura 5I-L), enquanto a segmentação incorreta não captará esses depósitos (Figura 6J-L). Portanto, é importante otimizar os métodos de coloração e imagem para evitar variações drásticas. Uma maneira de fazer isso é prestando muita atenção às etapas de permeabilização da amostra durante a imunomarcação. Para otimizar o sinal fluorescente, as células podem ser lisadas antes da fixação e imunomarcação para APOE, o que resulta em saturação uniforme e melhor segmentação dos depósitos de APOE.
Também são fornecidas imagens segmentadas de células amadurecidas em uma plataforma de cultura diferente de uma placa de 96 poços. O software LipidUNet foi executado em imagens de células cultivadas em um transwell, e enquanto os depósitos lipídicos são limiares, os poros na membrana do transwell também o são (Figura 6M-O). Devido à semelhança na forma e tamanho, o software LipidUNet em sua forma atual irá mascarar os depósitos lipídicos e transwell poros indiscriminadamente.
Figura 5: Resultados representativos. (A,E,I) 96 poços de RPE são corados com coloração nuclear Hoechst (azul) e vermelho Nilo (magenta), BODIPY (verde) ou APOE (laranja) e são as projeções de intensidade máxima de uma pilha Z. (B,F,J) As imagens de entrada em escala de cinza para o software LipidUNet após o processamento da imagem. (C,G,K) Máscaras geradas pelo LipidUNet, onde todos os depósitos são identificados corretamente. (D,H,L) Os contornos de cada partícula mascarada são numerados. Esses rótulos permitem conectar cada partícula na imagem a uma entrada no spreadheet com os dados brutos. (A-D) mostra a coloração de vermelho do Nilo, e o software é capaz de reconhecer os depósitos contra o fundo com precisão, apesar de um sinal mais fraco. (E-H) mostra um forte contraste entre o sinal BODIPY e o fundo, o que é ideal. LipidUNet identifica corretamente cada depósito na imagem. (I-L) mostra um forte sinal APOE e representa a variabilidade da saturação do sinal que é frequentemente observada com esta coloração. No entanto, a segmentação das imagens é capaz de identificar as bordas de cada depósito de APOE. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Resultados subótimos. (A,D,G,J,M) 96-bem chapeado RPE são corados com coloração nuclear Hoechst (azul) e vermelho Nilo (magenta), BODIPY (verde) ou APOE (laranja) e são as projeções de intensidade máxima de uma pilha Z. (B,E,H,K,N) As imagens de entrada em escala de cinza para o software LipidUNet após o processamento da imagem. (C, F, I, L, O) As máscaras incorretas geradas pelo LipidUNet. Círculos vermelhos indicam onde o software identificou incorretamente um depósito lipídico. (A-C) O processamento do Nile Red está incorreto porque o software identificou a coloração de fundo como um depósito. Isso pode acontecer com mais frequência quando há fundo alto, mas poucos depósitos lipídicos na imagem. Dois exemplos de coloração BODIPY são mostrados: uma imagem de baixa qualidade devido à coloração BODIPY fraca (D-F) e (G - I) um sinal BODIPY forte com alto fundo. Em ambos os casos, o software é incapaz de distinguir pequenos depósitos lipídicos circulares do anel circular de fundo que envolve o núcleo. Embora a coloração e a imagem devam ser otimizadas para evitar esses erros, a versão mais recente do LipidUNet foi amplamente melhorada para essas imagens. (J-L) Segmentação APOE incorreta. Como os depósitos são mais variáveis em tamanho e saturação de sinal, o software tem dificuldade em reconhecer alguns depósitos. (M-O) RPE semeado em um transwell e corado com Nile Red. Uma fatia da pilha Z é mostrada aqui com depósitos lipídicos vermelho-do-nilo e poros transwell. O software é incapaz de distinguir entre os dois, como mostrado pelo círculo vermelho contendo poros transwell e a seta verde apontando para depósitos de Nile Red. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Comparação da ferramenta de máscara. (A,B,C) PSE de 96 poços com quantidades variáveis de deposição lipídica são identificados com vermelho do Nilo (vermelho). As imagens são mascaradas usando três diferentes métodos de mascaramento comuns, Find Maxima, Max Entropy e Renyi Entropy, e comparadas com a máscara gerada pelo LipidUNet. A imagem original é acompanhada por uma contagem manual dos depósitos lipídicos, enquanto as máscaras exibem as contagens previstas por cada método de segmentação. A taxa de erro média foi calculada para cada método de segmentação usando a seguinte fórmula: média[(|Contagem Prevista - Contagem Manual|/Contagem Manual) x 100]. A máscara gerada pelo LipidUNet identifica com mais precisão os depósitos lipídicos nas imagens com deposição variável quando comparada a outros métodos de mascaramento (Taxas de erro médias: 23% LipidUnet, 1164% Find Maxima, 851% Max Entropy, 203% Renyi Entropy). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Componente | Número do gato | Estoque Conc. | Final Conc. | Ml |
MEM alfa | 12571-063 | NA | 500 | |
Suplemento N2 | 17502-048 | NA | 1% | 5 |
FBS inativado por calor | SH30071.03 | NA | 5% | 25 |
NMEM NEAA | 11140-050 | 10mM | 0.01mM | 5 |
Piruvato de Sódio | 11360-070 | 100mM | 1mM | 5 |
Penicilina-estreptomicina | 15140-122 | 10000u/mL | 100U/mL | 5 |
Taurina | T4571 | 50mg/mL | 250ug/mL | 2.5 |
Hidrocortisona | H6909 | 18,1mg/L | 20ug/l | 0.553 |
T3 | T5516 | 20ug/l | 0.013ug/l | 0.33 |
Volume total, mL | 548.383 |
Tabela 1: Composição do reagente PSE-MM. Uma lista de reagentes e concentrações ótimas para PSE-MM.
Este protocolo fornece um método para marcar, imagear e quantificar eficientemente depósitos lipídicos em modelos de doenças in vitro monogênicas e poligênicas para doenças oculares degenerativas. O software baseado em IA, LipidUNet, pode ser aplicado a três marcadores lipídicos comuns, APOE, Nile Red e BODIPY, e fornece um método rápido e automático de análise que permite que a quantificação seja padrão e imparcial.
A principal limitação do LipidUNet é o fato de que o conjunto de dados de treinamento para a IA foi limitado a imagens de aumento de 40x de células cultivadas em uma placa de 96 poços. Como resultado do conjunto de imagens de treinamento, o LipidUNet, em sua forma atual, limita-se a analisar imagens de aumento de 40x. O software pode ser usado para analisar imagens de 40x de células cultivadas em outras superfícies de cultura além de uma placa de 96 poços, mas deve-se ter cuidado ao examinar as máscaras de saída geradas para verificar o limiar preciso pelo software. Mais conjuntos de imagens (em diferentes ampliações) serão necessários para expandir o escopo de quais amostras/imagens ele pode analisar.
O protocolo tem várias etapas críticas. Na etapa do marcador lipídico, o usuário deve confirmar que seu composto de rotulagem escolhido (BODIPY, APOE, Nile Red) rotulou sua amostra de forma eficaz. As células maduras do EPR são frequentemente fortemente pigmentadas, o que pode prejudicar o sinal fluorescente da imunomarcação de anticorpos. Quando o sinal de fluorescência é fraco ou quando há muita coloração de fundo, LipidUNet não pode discernir gotículas lipídicas com precisão. Por uma razão semelhante, configurações de aquisição adequadamente selecionadas para a etapa de aquisição automática do protocolo devem ser usadas. Se as imagens adquiridas forem de baixa qualidade, o LipidUNet terá dificuldades para mascarar adequadamente as imagens e, portanto, a quantificação será imprecisa (Figura 6A-L). Finalmente, o pós-processamento das imagens é um passo importante, pois o LipidUNet possui requisitos específicos para que o software funcione.
Quando comparado a fluxos de trabalho para análise lipídica que usam limiares manuais ou técnicas que envolvem limiares automáticos em softwares como Fiji, o LipidUNet oferece uma segmentação não tendenciosa e confiável em imagens com deposição lipídica variável, refletida por uma pequena taxa de erro na identificação de partículas lipídicas (Figura 7). O software permite a entrada pelo usuário de imagens adicionais de treinamento, permitindo a análise de conjuntos de imagens além daquelas que utilizam uma objetiva de aumento de 40x ou mesmo aquelas que utilizam um marcador lipídico diferente, conforme descrito no protocolo. No futuro, o software será treinado para analisar imagens 3D para que a quantificação do volume de depósito lipídico seja possível. Doenças oculares degenerativas que implicam a deposição lipídica como um dos principais contribuintes para a patologia são prevalentes, e prevê-se que os casos aumentem à medida que a população idosa está se expandindo13. Modelos de doença precisos e ferramentas de análise eficientes, como delineamos neste protocolo, permitirão o desenvolvimento de novas intervenções terapêuticas.
Agradecemos ao núcleo de histologia do National Eye Institute (NEI) pelo uso do sistema confocal Zeiss. Este trabalho foi apoiado por fundos do NEI IRP (número de processo ZIA EY000533-04).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.22 µm Steriflip filter system | EMD Millipore | SCGP00525 | |
1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | |
3,3',5-Triiodo-L-thyronine | Sigma | T5516 | |
Albumin Bovine, Fraction V | MP Biomedical | 160069 | |
Alexa Fluor 555 rabbit anti-goat IgG (H+L) | Invitrogen | A21431 | APOE secondary antibody |
APOE primary antibody | Millipore Sigma | AB947 | |
BODIPY 493/503 | Invitrogen | D3922 | Protect from light |
Complement competent human serum | Millipore Sigma | S1-LITER | |
CTS N2 Supplement | Life Technologies | A13707-01 | |
Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30071.03 | |
Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | Slide mounting media |
Glass Cover Slips #1 1/2 22 mm x 22 mm | Electron Microscopy Sciences | 72204-01 | |
Glass Microscope Slide 25 mm x 75 mm- 1.2 mm Thick | Electron Microscopy Sciences | 71870-01 | |
Hydrocortisone | Sigma | H0396 | |
MEM Alpha | Life Technologies | 12571-063 | |
MEM non-essential Amino Acids | Life Technologies | 11140 | |
Nile Red | Sigma | 72485-100MG | Protect from light |
Paraformaldehyde 16% Solution, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
Penicillin-Strep | Life Technologies | 15140-148 | |
Phosphate Buffered Saline 10x | Gibco | 70011-044 | |
Rod Outer Segments (OS) | InVision Bioresources | 98740 | |
Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
Sodium Pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
Sucrose | Sigma Aldrich | S1888 | |
SYBR Green Master Mix | Bio-Rad | 1725274 | |
Taurine | Sigma | T0625 | |
Triton X-100 | Sigma | 9002-93-1 | |
Tween 20 Ultrapure | Affymetrix | 9005-64-5 | |
Vitronectin | Life Technologies | A14701SA | |
Y-27632 dihydrochloride | R&D Systems | 1254 |
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