Abordagem única para isolar neutrófilos de medula óssea de rato com capacidade comparável

Summary

Esta pesquisa descreve duas técnicas para isolar abundantes armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) da medula óssea de ratos. Um método combina um kit comercial de isolamento de neutrófilos com centrifugação por gradiente de densidade, enquanto o outro emprega apenas centrifugação por gradiente de densidade. Ambas as abordagens produzem NETs funcionais superando as dos neutrófilos do sangue periférico.

Abstract

O objetivo primário desta pesquisa foi desenvolver uma abordagem confiável e eficiente para isolar armadilhas extracelulares (NETs) de neutrófilos da medula óssea de ratos. Esse esforço surgiu devido às limitações associadas ao método tradicional de extração de TNEs do sangue periférico, principalmente devido à escassez de neutrófilos disponíveis para isolamento. O estudo revelou duas metodologias distintas para a obtenção de neutrófilos de rato a partir da medula óssea: um procedimento simplificado de uma etapa que produziu níveis de purificação satisfatórios e um processo de duas etapas mais demorado que exibiu maior eficiência de purificação. É importante ressaltar que ambas as técnicas produziram uma quantidade substancial de neutrófilos viáveis, variando entre 50 a 100 milhões por rato. Essa eficiência refletiu os resultados obtidos com o isolamento de neutrófilos de fontes humanas e murinas. Significativamente, neutrófilos derivados da medula óssea de ratos exibiram habilidades comparáveis para secretar NETs quando comparados com neutrófilos obtidos de sangue periférico. No entanto, o método baseado na medula óssea produziu consistentemente quantidades notavelmente maiores de neutrófilos e NETs. Esta abordagem demonstrou o potencial de obter quantidades significativamente maiores desses componentes celulares para futuras aplicações a jusante. Notavelmente, esses NETs isolados e neutrófilos são promissores para uma variedade de aplicações, abrangendo os domínios da inflamação, infecção e doenças autoimunes.

Introduction

Os neutrófilos constituem um subconjunto crítico de leucócitos que desempenham um papel fundamental na resposta imune inata. Caracterizam-se por núcleos multilobados e grânulos contendo várias proteases e peptídeos antimicrobianos1. Os neutrófilos funcionam principalmente através da degranulação, fagocitose e formação de NETs. A observação dos TNEs foi feita pela primeira vez por Takei e col. em 1996, durante um experimento em que neutrófilos foram estimulados com acetato de miristato de forbol (PMA)². Posteriormente, o processo de formação da NET foi denominado "NETosis" por Brinkmann et ^al.3 em ....

Protocol

O estudo foi realizado sob uma licença de projeto (No. 20211404A) concedida pelo Comitê de Ética Animal do West China Hospital, Sichuan University, em conformidade com as diretrizes do Comitê de Ética Animal do West China Hospital, Sichuan University para o cuidado e uso de animais. De acordo com as diretrizes éticas, os ratos utilizados neste estudo foram mantidos em ambiente controlado com ciclo claro/escuro de 12 h, temperatura de 22-24 °C e umidade de 50%-60%. Os ratos tiveram acesso a ração e água ad libit.......

Discussion

O isolamento de neutrófilos constitui uma etapa fundamental no estudo da NETosis, onde a seleção de um método de isolamento apropriado é fundamental para a obtenção de resultados confiáveis. Um fator importante a pesar é a ocorrência de contaminação linfocitária durante o isolamento. Enfrentar esse desafio é particularmente significativo ao isolar neutrófilos de rato da medula óssea. Apesar da distinta faixa de densidade de neutrófilos (1,0814-1,0919, com pico em 1,0919) em relação aos linfócitos (1,0.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
A488-conjugated donkey antirabbit IgG(H + L)	Invitrogen, USA	A32790
A594-conjugated donkey anti-mouse IgG(H + L)	Invitrogen, USA	A32744
A594-conjugated goat anti-Mouse IgG1	Invitrogen, USA	A21125
Anti-rat myeloperoxidase	Abcam, England	ab134132
Anti-rat neutrophil elastase	Abcam, England	ab21595
Celigo Image Cytometer	Nexelom, USA	200-BFFL-5C
DNase I	Sigma, USA	10104159001
fetal bovine serum (FBS)	Gibco, USA	10099141C
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco, USA	C14175500BT
Hoechst	Thermofisher, USA	33342
Isoflurane	RWD, China	R510-22-10
Mowiol	Sigma, USA	81381
Normal Donkey Serum	Solarbio, China	SL050
Paraformaldehyde	biosharp, China	BL539A
Penicillin-streptomycin	Hyclone, USA	SV30010
Percoll	GE, USA	P8370-1L
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Sigma, USA	P1585
Picogreen dsDNA Assay Kit	Invitrogen, USA	P11496
Rat neutrophil isolation kit	Solarbio, China	P9200
Red blood cell lysis buffer	Solarbio, China	R1010
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) media	Hyclone, USA	SH30809.01B
RWD Universal Animal Anesthesia Machine	RWD, China	R500
Sprague Dawley (SD) rats	Dashuo, China
SytoxGreen	Thermofisher, USA	S7020
Tris-EDTA (TE) buffer	Solarbio, China	T1120
Triton-X-100	Biofroxx, German	1139ML100