CorrelationCalculator と Filigree: メタボロミクスデータのデータ駆動型ネットワーク解析ツール

要約

本稿では、メタボロミクスデータのデータ駆動型ネットワーク構築と解析のための2つのツールであるCorrelationCalculatorとFiligreeを紹介します。 CorrelationCalculator は、発現データに基づく代謝物の単一の相互作用ネットワークの構築をサポートし、Filigree は差動ネットワークの構築と、それに続くネットワークのクラスタリングと濃縮分析を可能にします。

要約

オミクスデータの解析における重要な課題は、実用的な生物学的知識を抽出することです。メタボロミクスも例外ではありません。個々の代謝産物のレベルの変化を特定の生物学的プロセスに関連付けるという一般的な問題は、ノンターゲット液体クロマトグラフィー質量分析(LC-MS)研究に存在する多数の未知の代謝物によって悪化します。さらに、二次代謝と脂質代謝は、既存のパスウェイデータベースでは十分に表現されていません。これらの限界を克服するために、私たちのグループでは、データ駆動型ネットワークの構築と解析のためのいくつかのツールを開発しました。これらには、CorrelationCalculator と Filigree が含まれます。どちらのツールも、代謝物の数がサンプル数を超えた場合に、実験メタボロミクスデータから部分相関ベースのネットワークを構築できます。CorrelationCalculator は 1 つのネットワークの構築をサポートしますが、Filigree では 2 つのサンプル グループからのデータを利用して差分ネットワークを構築し、その後にネットワーク クラスタリングとエンリッチメント分析を行うことができます。本稿では、実際のメタボロミクスデータを解析するための両ツールの有用性と応用について述べる。

概要

過去10年間で、メタボロミクスは、ガスクロマトグラフ質量分析(GC-MS)や液体クロマトグラフィー質量分析(LC-MS)などの分析技術の進歩により、オミクス科学として登場しました。これらの技術により、数百から数千の低分子代謝物を同時に測定し、複雑な多次元データセットを作成できます。メタボロミクス実験は、ターゲットモードまたはノンターゲットモードで実行できます。ターゲットメタボロミクス実験では、特定のクラスの代謝物を測定します。それらは通常仮説主導型ですが、ノンターゲットアプローチはできるだけ多くの代謝物を測定しようとし、本質的に仮説を生成します。ターゲットアッセイには通常、内部標準が含まれているため、目的の代謝物の絶対定量が可能です。対照的に、ノンターゲットアッセイでは相対定量が可能で、多くの未知の代謝物^{が含まれています1。}

メタボロミクスデータの解析は、多くの専用^{ソフトウェアツールを}活用する多段階のプロセスです1。大きく分けて、(1)データ処理と品質管理、(2)統計解析、(3)生物学的データの解釈の3つに分けられます。ここで説明するツールは、解析の後半のステップを可能にするように設計されています。

メタボロミクスデータを解釈する直感的で一般的な方法は、実験測定値を代謝経路にマッピングすることです。この^2,3,4,5を実現するために、私たちのグループ6によって開発されたMetscapeを含む多くのツールが設計されました。パスウェイマッピングは、多くの場合、最も重要なパスウェイを特定するのに役立つエンリッチメント分析と組み合わされます^7,8。これらの手法は、遺伝子発現データの解析において最初に注目され、プロテオミクスおよびエピゲノミクスデータの解析に応用されてきました9,10,11,12,13。しかし、メタボロミクスデータの解析には、知識ベースのアプローチには多くの課題があります。まず、メタボロミクスアッセイでは、内因性代謝物に加えて、栄養やその他の環境源に由来するものを含む外因性化合物を測定します。これらの化合物は、細菌によって産生される代謝産物と同様に、他の真核生物のヒトまたは代謝経路にマッピングすることはできません。さらに、二次代謝および脂質代謝の経路カバレッジは、現在、データの生物学的解釈を容易に支持するレベルでの高解像度マッピングを可能にしていない^14,15。

データ駆動型のネットワーク解析手法は、これらの課題の克服に役立ちます。例えば、相関ベースのネットワークは、既知および未知の両方の代謝物間の関係を導出し、未知物質のアノテーションを容易にする¹⁶。ピアソンの相関係数を計算することは、代謝物間の線形関係を確立するための最も簡単なアプローチですが、欠点は、直接的および間接的な関連性17,18,19の両方を捉えることです。別の方法として、直接的な関連性と間接的な関連性を区別できる偏相関係数を計算する方法があります。ガウス グラフィカル モデリング (GGM) を使用して、偏相関ネットワークを推定できます。ただし、GGMでは、サンプルサイズと特徴の数が同等である必要があります。この条件は、何千もの代謝特性の測定値を含むノンターゲット LC-MS データではめったに満たされません。正則化手法は、この制限を克服するために利用できます。グラフィカルななげなわ(Glasso)とノードワイズ回帰は、偏相関ネットワーク^16,20の正則化推定のための一般的な方法です。

ここで紹介するバイオインフォマティクスツールの最初の CorrelationCalculator¹⁶ は、偏りのない疎部分相関 (DSPC) アルゴリズムに基づいています。DSPC は、疎分散化されたグラフィカルななげなわモデリングに依存しています。アルゴリズムの根底にある仮定は、代謝産物間の結合の数がサンプル数よりもかなり少ない、つまり代謝産物の偏相関ネットワークが疎であるということです。この仮定により、DSPCは、正則化された回帰手法を活用して、より少ないサンプルで多数の代謝物間の接続性を発見できます。さらに、正則化された回帰推定値にバイアス除去ステップを使用して、信頼区間を構築し、関心のある仮説(たとえば、単一またはエッジのグループの有無)をテストするために使用できるエッジパラメータのサンプリング分布を取得します。したがって、偏相関ネットワークにおけるエッジの有無は、計算されたp値を使用して正式にテストできます。

CorrelationCalculator は、単一グループ分析に非常に役立つことが証明されました¹⁶。しかし、多くのメタボロミクス実験の目的は、2つ以上の条件の差動分析です。CorrelationCalculator を各グループで個別に使用して、各条件の偏相関ネットワークを生成できますが、この方法では、ネットワーク生成に使用できるサンプルの数が制限されます。データドリブン解析では、サンプルサイズが十分に大きいことが最大の考慮事項の1つであるため、データ内の利用可能なすべてのサンプルを活用してネットワークを構築できる手法が強く望まれます。このアプローチは、ここで紹介する 2 番目のツールである Filigree²¹ に実装されています。Filigreeは、以前に公開された差分ネットワークエンリッチメント分析(DNEA)アルゴリズム²²に依存しています。 表 1 は、両方のツールのアプリケーションとワークフローを示しています。

実験条件数(k)	k = 1	k = 2
ソフトウェアツール	相関電卓	細工
入力データ	• 代謝物 x サンプルデータマトリックス	• 代謝物 x サンプルデータマトリックス • 実験グループ
ワークフロー •前処理 • ネットワーク推定 • ネットワーク クラスタリング • エンリッチメント分析	•ログ変換。自動スケーリング • DSPC (英語) •外部アプリ経由 •いいえ	•ログ変換。自動スケーリング • 共同ネットワーク推定 • コンセンサスクラスタリング • NetGSAの
データの可視化	外部アプリ(例:Cytoscape)経由	外部アプリ(例:Cytoscape)経由
関心のある結果との関連について代謝モジュールをテストする(オプション)	外部アプリ経由	外部アプリ経由

表1:CorrelationCalculatorとFiligreeの適用範囲とワークフロー。

プロトコル

1.相関電卓

1. http://metscape.med.umich.edu/kora_data_240.csv での実験的測定値を含む代謝物のリストを含むサンプルのコンマ区切り入力ファイルをダウンロードします。
2. ダウンロードしたサンプルファイルをダブルクリックして開きます。
   1. ファイルにサンプルと代謝物の両方のラベルが含まれていることを確認します。
   2. サンプルは行単位であるため、最初の列がサンプル名、最初の行が代謝物名であることを確認します。
3. CorrelationCalculator Java アプリケーション (http://metscape.med.umich.edu/calculator.html) をダウンロードします。ダウンロードした .jar ファイルをダブルクリックして、アプリケーションを起動します。
4. 「入力」タブで、「参照」ボタンをクリックして入力ファイルをアップロードします。
5. [ ファイル形式の指定] で、ドロップダウン矢印を使用して適切な入力ファイル形式を選択します。行内の サンプル を選択します(補足図1)。
6. ウィンドウの右下にある [Next >>] ボタンをクリックして、[Data Normalization] タブに移動します。
7. [Select Method(s)] で、[Log2-Transform Data] の横のチェックボックスをオンにします。[データの自動スケーリング] の横にあるチェックボックスをオンにします。
8. [データの正規化] で [実行] ボタンをクリックします。
   注: 正規化が完了したら、[データの正規化] の下にある [正規化されたデータの表示] ボタンをクリックし、更新されたデータセットを確認します (補足図 2)。
9. [ データの正規化] で [ 保存 ] ボタンをクリックし、新しいデータ ファイルを保存します。
10. ウィンドウの右下にある「次の>>」ボタンをクリックして、「データ分析」タブに移動します。
11. ピアソンの相関の計算で、実行をクリックします。データに最適なピアソンの相関範囲を決定します。
    1. [ ヒストグラムの表示 ] ボタンをクリックします。特徴量ごとの最大ピアソン相関スコアの頻度を確認します。
    2. [ ヒートマップの表示 ] ボタンをクリックします。ピアソンの相関行列の表現を確認します。
12. ピアソンの相関関係によるフィルターで、0.00から1.00の範囲でフィルターするデフォルトの数値のままにします
    注: 右端の小さな青い矢印を 1 からスライドさせ、左側の小さな青い矢印を 0 からスライドさせて、フィルターを変更します。テキストボックスに特定の番号を入力することもできます。
13. [ Select Partial Correlation Method] で、目的の [ DSPC Method] を選択します。
    注:代謝物の数がデータセット内のサンプル数よりも少ない場合は、DSPC法のみを使用できます。
14. [Calculate Partial Correlations] で [Run] ボタンをクリックします (補足図 3)。
15. [ CSV ファイルの表示 ] をクリックし、結果を表示します。[ 保存 ] ボタンをクリックして、結果を保存します。
16. [ MetScape で表示 ] ボタンをクリックして、対話型の相関ネットワークを起動します。
    MetScape の使用の詳細については、Karnovsky, A. et ^al.6 を参照してください。
    注:MetScapeは、相関ネットワークの作成と探索を可能にするCytoscapeアプリケーションです。

2.フィリグリー

1. http://metscape.med.umich.edu/T1D_primaryMetabolites_noIS_log_scaled_sorted.csv での代謝物測定値を含むサンプルのカンマ区切り入力ファイルをダウンロードします。
2. ダウンロードしたサンプルファイルをダブルクリックして開きます。
   1. ファイルの列 1 にサンプル名が含まれ、列 2 にグループ割り当てが含まれていることを確認します。残りのカラムに代謝物/脂質が含まれていることを確認します。
   2. 各行がサンプルを表していることを確認します。
      注:代謝物の測定値は、特徴の集約を実行しない限り、対数変換および自動スケーリングする必要があり、その場合は測定値は対数変換のみにする必要があります。
3. Filigree Java アプリケーション (http://metscape.med.umich.edu/filigree.html) をダウンロードします。
   注意: 詳細なユーザーマニュアルは http://metscape.ncibi.org/v0.1.2Filigree_UserManual.pdf で入手できます。
4. ダウンロードした .jar ファイルをダブルクリックして、アプリケーションを起動します。
5. [ データ ] タブで [ 参照 ] ボタンをクリックして、入力ファイルをアップロードします。
6. [ Specify Columns/Rows] で、[ Sample ID ] の横にあるドロップダウン矢印をクリックして、入力ファイルから対応する列/行名を選択します。[ サンプル] を選択します。
7. [列/行の指定]で、[グループ]の横にあるドロップダウン矢印をクリックして、入力ファイルから対応する列/行を選択します。[グループ] を選択します。
8. [ サンプル グループの指定] で、各グループの横にあるドロップダウン矢印をクリックして、入力ファイルから対応する グループ 列を選択します。 [グループ 1] で [ 糖尿病] を選択します。 [グループ 2] で [ 非糖尿病] を選択します。
9. [Feature Grouping] で、目的の方法の [Calculate Feature Groups] の横にあるチェックボックスをオンにします。
10. [ ヒートマップの表示 ] ボタンをクリックします。ヒートマップを表示し、必要な削減率を決定します。
11. [ 特徴量削減] スライダーを使用して、特徴量の削減率を選択します。減少率が 1.25 の特徴とサンプルの比率を示すまで、小さな円をスライドさせます(補足図 4)。
12. ウィンドウの右下にある[次へ>>]ボタンをクリックして、[分析]タブに移動します。
13. 「出力ディレクトリの選択」で、「参照」ボタンをクリックし、生成された出力ファイルを保存する ディレクトリの場所を選択します。
14. ウィンドウの左下にある[ 分析の実行 ]ボタンをクリックします。プログレスバーは、分析コンポーネントごとに更新されます(補足図5)。ポップアップウィンドウの[ OK ]ボタンをクリックして、「 Analysis Completed Successfully」というメッセージを表示します。
15. [ 解析 ] タブで [ネットワーク の参照 ] ボタンをクリックして、対話型のフィリグリー サブネットワークをブラウザー タブで開きます。
16. [サブネットワーク名] 列の下にある [サブネットワーク 1] リンクをクリックします。
17. さまざまなボタンを使用して対話型サブネットワークを探索します。 [+ ] ボタンをクリックして、ネットワークの一部を拡大します。[-] ボタンをクリックしてズームアウトします (補足図 6)。
18. グループノードをクリックしてドラッグし、サブネットワーク内で再配置します。
    注:ノードの色はアップ/ダウンレギュレーションを表し、色の不透明度は高/低のフォールドの変化を表します。エッジの色は、グループ間の差分状態を表します。
19. ページの右上にある [フィーチャの展開 ] ボタンをクリックして、すべてのグループ ノードを展開します。グループ ノードを構成する特定のコンパウンドを確認します。
20. ページの右上にある [ フィーチャを折りたたむ ] ボタンをクリックして、最近展開したグループ ノードを折りたたみます。
21. ページの右上にある [ サンプル グループ別 ] ボタンをクリックして、ビューを 1 つのサブネットワークからグループで分割された複数のサブネットワークに変更します。このサブネットワークのビューを使用して、グループを探索して比較します (補足図 7)。
22. [ すべてのサンプル ] ボタンをクリックして、1 つのサブネットワーク ビューに戻ります。
23. ページの右上にある [ 次へ ] ボタンをクリックして、次のサブネットワークを表示します。
24. サブネットワークごとに手順 2.19 から 2.23 を繰り返します。
25. ウィンドウの上部中央にある [ 差分ネットワーク情報付加解析結果 ] リンクをクリックして、すべてのサブネットワークをリストしたサマリー テーブル ビューに戻ります。
    注:エッジやノードの出力ファイルをCytoscape²³などの別のソフトウェアツールにインポートして、追加のネットワーク可視化を作成します。

3. その他の考慮事項

1. Big Sur(OSX 11.2)以降を実行しているMacコンピュータの場合は、 Appleメニュー>システム環境設定>セキュリティとプライバシー>一般で ツールを承認し、タブの下部にある[ 許可 ]を選択します。
2. さらに、左側のメニューで「ファイルとフォルダ」を選択し、右側のメニューで「フィリグリー」を選択して、Apple メニュー>システム環境設定>セキュリティとプライバシー>ファイルへのアクセスを Filigree に許可します。

結果

CorrelationCalculatorの使用を説明するために、 Krumsiek et ^al.24に記載されているKORA集団研究のメタボロミクスデータのサブセットを使用して偏相関ネットワークを構築しました。データセットには、151 の代謝物と 240 のサンプルが含まれていました。 図1 は、Cytoscapeで可視化した偏相関ネットワークを示しています。ネットワークには 148 個のノード?...

ディスカッション

CorrelationCalculator と Filigree に実装された部分相関ベースのネットワーク解析手法は、特に未知の代謝物の有病率が高く、代謝経路のカバレッジが限られているデータセット(リピドミクスデータなど)において、知識ベースの代謝経路解析の限界を克服するのに役立ちます。これらのツールは、幅広いメタボロミクスおよびリピドミクスデータを分析するために研究コミュニティで広く使用され...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
CorrelationCalculator	JAVA	http://metscape.med.umich.edu/calculator.html
clusterNet		https://github.com/Karnovsky-Lab/clusterNet
Cytoscape	Cytoscape	https://cytoscape.org/
Filigree	JAVA	http://metscape.med.umich.edu/filigree.html
MetScape	Cytoscape	https://apps.cytoscape.org/apps/metscape	Cytoscape application that allows for the creation and exploration of correlation networks.