Введение в обработку, подгонку и интерпретацию данных о нестационарном поглощении

Summary

Этот протокол является начальным этапом обработки, подгонки и интерпретации спектров нестационарного поглощения. Основное внимание в этом протоколе уделяется подготовке наборов данных и аппроксимации с использованием как одноволновой кинетики, так и глобального анализа времени жизни. Обсуждаются проблемы, связанные с данными о переходных процессах поглощения и их подгонкой.

Abstract

Спектроскопия нестационарного поглощения (ТА) является мощным спектроскопическим методом с временным разрешением, используемым для отслеживания эволюции процессов в возбужденном состоянии через изменения спектра поглощения системы. Ранние внедрения ТА были ограничены специализированными лабораториями, но эволюция коммерческих систем «под ключ» сделала этот метод все более доступным для исследовательских групп по всему миру. Современные системы ТА способны генерировать большие наборы данных с высоким энергетическим и временным разрешением, богатые фотофизической информацией. Однако обработка, подгонка и интерпретация спектров ТА может быть сложной задачей из-за большого количества признаков возбужденного состояния и инструментальных артефактов. При сборе, обработке и подгонке данных ТА необходимо тщательно учитывать множество факторов, чтобы уменьшить неопределенность в отношении того, какая модель или набор параметров аппроксимации лучше всего описывает данные. Цель подготовки и подгонки данных состоит в том, чтобы уменьшить как можно больше этих посторонних факторов, сохраняя при этом данные для анализа. В этом методе новичкам предоставляется протокол обработки и подготовки данных ТА, а также краткое введение в выбранные процедуры и модели подгонки, в частности, подгонка с одной длиной волны и глобальный анализ срока службы. Приводятся комментарии по ряду часто встречающихся проблем подготовки данных и методам их решения, за которыми следует обсуждение проблем и ограничений этих простых методов подгонки.

Introduction

Спектроскопия нестационарного поглощения (ТА) — это спектроскопический метод с временным разрешением, который отслеживает эволюцию фотовозбужденных частиц путем зависящих от времени изменений их спектра поглощения после возбуждения световым импульсом. Поскольку ТА является абсорбционным методом, спектроскопические сигналы, возникающие из состояний, которые претерпевают как радиационные переходы (т.е. состояния, которые обычно испускают фотон), так и безызлучательные переходы (состояния, которые, как правило, являются нефлуоресцентными и претерпевают внутреннюю конверсию, межсистемное пересечение или участвуют в фотореакциях), могут быть идентифицированы, и их эволюция может быть проследим ^1,2. В зависимости от специфики источника возбуждения и метода детектирования, ТА позволяет получить доступ к кинетике от фемтосекунд до микросекунд и от ультрафиолета до дальнего ИК, что делает его универсальным спектроскопическим инструментом. За последние несколько десятилетий коммерциализация ТА-спектрометров значительно продвинулась вперед, что привело к тому, что все больше лабораторий и учреждений имеют доступ к этому мощному методу².

Современные системы ТА способны генерировать большие наборы данных с высоким энергетическим и временным разрешением. Наборы данных обычно имеют форму 2D-матрицы значений разности коэффициентов пропускания или поглощения в зависимости от длины волны и временной задержки относительно импульса возбуждения. Этот набор данных можно просматривать в виде двухмерной тепловой карты или трехмерной топографической карты. Интерпретация этих данных стала более сложной, поскольку исследователи стремятся включить весь набор данных при создании подходов, которые наилучшим образом описывают интересующую их систему³.

Несмотря на то, что ТА может охватывать широкий диапазон длин волн и временных масштабов, этот протокол фокусируется на одной из его наиболее широко^{доступных форм:} широкополосной спектроскопии в УФ-видимой области, управляемой фемтосекундным импульсным лазером. Схема ^5,6 такого прибора приведена на рисунке 1. Эксперимент начинается с того, что происходит взятие импульса от лазера и разделение его на две копии. Одна копия импульса, называемая «насосом», используется для возбуждения образца. Такое устройство, как оптический параметрический усилитель (ОПА), обычно используется для преобразования импульса накачки в желаемую длину волны возбуждения ^5,7. Вторая копия импульса, называемая «зондом», входит в стадию механической задержки, которая может изменять временную задержку между импульсами накачки и зонда, изменяя расстояние, которое проходит импульс. Затем одноволновый зондирующий импульс преобразуется в континуум белого света с помощью кристалла⁸ сапфира или фторида кальция (CaF₂). Импульс белого света пропускается через образец, и его спектр измеряется с помощью широкополосного детектора, такого как ПЗС-камера. Измеряя изменения в спектре импульса белого света с насосом и без него, можно измерить изменения в спектре поглощения образца, индуцированные насосом, ΔA(T). Заинтересованные читатели могут обратиться к этому полезному обзору⁹ для получения дополнительной информации о процессе обнаружения.

Во всех формах ТА-спектроскопии спектры ΔA(t) рассчитываются путем взятия разности между поглощением в основном состоянии,_зондом A, и поглощением в возбужденном состоянии,_{A pump+probe}, с заданной временной задержкой, t, между двумя импульсами 2,5,9,10.

(1)

Обратите внимание, что_зонд эквивалентен стационарному спектру поглощения образца и не зависит от времени; временное разрешение эксперимента обусловлено задержкой между насосом и зондом, захваченным в схеме_{A pump+probe}(t). Моделирование этих данных показано на рисунке 2A.

В отличие от стационарных спектров поглощения, спектры ТА могут иметь как положительные, так и отрицательные характеристики из-за разницы, взятой в уравнении 1. Положительные свойства являются результатом появления новых поглощающих веществ, создаваемых импульсом накачки, и могут представлять собой возбужденные хромофорные состояния, триплетные состояния, геометрические перегруппировки, сольватационные эффекты или возбужденные фотопродукты³. В ходе дискуссии будут представлены общие рекомендации по выявлению этих признаков и отнесению их к химическим видам. Негативные свойства могут возникать либо из-за основного отбеливателя (GSB), либо из-за вынужденной эмиссии (SE) (рис. 2B). GSB возникает из-за потери популяции наземного состояния после поглощения импульса накачки. Молекулы, переведенные в возбужденное состояние, больше не поглощаются в той же области, что и их основное состояние; следовательно, поглощается меньшая часть зондирующего импульса, и разница в уравнении 1 может быть отрицательной в этой области. GSB характеризуется тем, что имеет ту же спектральную форму, что и поглощение в основном состоянии, но с противоположным знаком. Сигналы SE возникают в результате излучения возбужденного вещества, стимулируемого зондирующим импульсом³. Излучение этих частиц приводит к тому, что к детектору попадает больше света , что эквивалентно меньшему поглощению на этих длинах волн. Сигнал SE будет иметь ту же спектральную форму, что и спектр спонтанного излучения вида, но с отрицательным знаком и другим частотным весом¹⁰.

В дополнение к информации о видах, находящихся в возбужденном состоянии, спектры ТА могут содержать ряд артефактов и посторонних особенностей, которые могут искажать лежащую в основе динамику и затемнять распределение полос поглощения¹¹. Ненадлежащее обращение с этими артефактами при подготовке и анализе данных может привести к применению к ним ненадлежащих фотофизических моделей и, как следствие, к вводящим в заблуждение выводам¹¹. Поэтому первая часть этого протокола посвящена тому, как правильно обрабатывать наборы данных ТА после их сбора. Цель этого раздела — предоставить исследователям, не знакомым с ТА, набор рекомендаций, которые помогут развить интуицию и понимание тщательной подготовки и обработки своих данных.

После обработки набора данных доступно множество инструментов и моделей для подгонки и интерпретации спектров с различными уровнями сложности и строгости¹⁰. Цель второго раздела этого протокола состоит в том, чтобы подготовить читателя к применению одноволновой аппроксимации и глобального анализа к данным, а также дать рекомендации относительно того, когда эти модели подходят для описания своих данных. В настоящее время доступно коммерческое программное обеспечение для подготовки и обработки данных ТА, такое как Surface Xplorer^12,13 от Ultrafast systems (бесплатно для загрузки и использования, см. Таблицу материалов). Другие бесплатные альтернативы были выпущены академическими исследователями, такие как Glotaran¹⁴. Glotaran — это свободная программа, разработанная для глобального и целевого анализа данных спектроскопии и микроскопии с временным разрешением. Он служит графическим пользовательским интерфейсом (GUI) для R-пакета TIMP¹⁴. Кроме того, пользователи могут использовать языки программирования, такие как Python, для написания собственных кодов, выполняющих анализ. Каждое из этих подходящих программных и программных решений имеет положительные особенности, которые делают их важным вкладом. Для целей данного исследования мы можем представить только одно программное обеспечение для визуальной составляющей этой деятельности. Подробное обсуждение каждого программного обеспечения для фитинга выходит за рамки этой статьи.

В этой статье представлена пошаговая процедура (1) обработки данных ТА, (2) аппроксимации данных ТА с использованием одноволновой кинетики и глобального анализа, и (3) извлечения данных и их подгонки к другим моделям. В книгу включен набор репрезентативных данных ТП, которые читатель может использовать в качестве практики (Дополнительный файл 1 и Дополнительный файл 2). Данные представляют собой измерение образца 1,4-бис(5-фенилоксазол-2-ил)бензола (POPOP) размером 165 мкМ в этаноле, возбужденного при длине волны 330 нм и собранного в диапазоне от −5 пс до 5,5 нс. Кроме того, в тех же экспериментальных условиях в диапазоне от −5 до 5 пс был отобран «пустой» образец, содержащий только этанол и не содержащий ни одной пробы, что используется при подготовке данных для подгонки (шаг 1). Спектры собирали с помощью сверхбыстрого спектрометра нестационарного поглощения. Образец помещали в кювету длиной 2 мм и подвергали постоянному перемешиванию. Описанная процедура обработки и подгонки основана на программном обеспечении Surface Xplorer, которое помещает данные в формате *.ufs и будет называться «программой подгонки». Доступны программы для конвертации наборов данных в других форматах в файлы *.ufs¹⁵. Несмотря на то, что детали этого протокола специфичны для Surface Xplorer, следующие шаги можно обобщить для любого пакета программного обеспечения, коммерческого или самодельного. Кроме того, результаты обработки данных могут быть извлечены и сопоставлены с помощью этих других программных пакетов. В сопроводительном информационном файле (Дополнительный файл 3) содержатся дополнительные рекомендации по подгонке.

Protocol

1. Подготовка данных для подгонки

1. Загрузите набор данных SAMPLE в программу Fitting. Данные будут отображаться, как показано на дополнительном рисунке 1.
2. Если рассеянный возбуждающий свет присутствует в оптическом окне детектирования эксперимента, используйте опцию Subtract Scattered Light (Вычитание рассеянного света ) (Дополнительный рисунок 2). Если в данных нет рассеянного возбуждающего света, перейдите к шагу 1.5.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рассеянный свет чаще всего наблюдается, когда длина волны возбуждения попадает в оптическое окно. Рассеянный свет проявляется в виде резкого отрицательного (отбеливающего) признака на длине волны возбуждения (или некотором порядке дифракции, или длине волны, полученной в OPA), которая не изменяется со временем.
3. Щёлкните по меню Surface , затем выберите опцию Subtract Scattered Light (дополнительный рисунок 2). Появится новое окно.
4. В новом окне нажмите кнопки со стрелками , чтобы установить среднее количество фоновых спектров (дополнительный рисунок 3) для выполнения коррекции фона. Использование десяти спектров является хорошей отправной точкой, и их количество может быть скорректировано по желанию. Нажмите « Принять », чтобы выполнить вычитание (перейдите к шагу 1.7).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Фоновые спектры берутся из первых спектров, присутствующих в наборе данных, а затем перемещаются вперед во времени, используя столько фоновых спектров, сколько необходимо для обеспечения усреднения фонового сигнала; Тем не менее, использование слишком большого количества приведет к использованию спектров, содержащих интересующий сигнал, поэтому не используйте слишком много. При использовании данных с длительным временным окном признак рассеяния может не отображаться в конце временного окна данных. Это может произойти, если временное окно превышает время интеграции камеры, или по другим причинам, зависящим от того, как построен эксперимент ТА. Чтобы исправить это, можно использовать опцию «Задать диапазон времени», как описано в Дополнительном файле 3.
5. Для данных, в которых отсутствует рассеянный свет в оптическом окне, щелкните меню «Поверхность», затем выберите опцию «Вычесть фон».
6. В появившемся окне нажмите кнопки со стрелками в правом нижнем углу, чтобы «Количество спектров» усреднилось (выберите 10), и нажмите «Принять».
   ПРИМЕЧАНИЕ: Фоновые спектры в этой опции функционируют так же, как и в опции "Вычесть рассеянный свет". Начало с десяти спектров обеспечивает хорошее усреднение. Можно использовать больше спектров, но следует соблюдать осторожность, чтобы не использовать слишком много, чтобы избежать включения спектров, содержащих интересующие сигналы. В руководстве пользователя Surface Xplorer описаны различия в коррекции, применяемой для «Вычитания рассеянного света» и «Вычитания рассеянного света». более простая коррекция «Вычитание фона». Важно применить соответствующую коррекцию для артефакта¹⁶.
7. Данные, расположенные вблизи краев оптического окна, могут иметь очень низкое отношение сигнал/шум из-за формы спектра зонда и/или поглощения образцом слишком большого количества белого света. Зашумленные данные в этих регионах затрудняют анализ. Удалите эти бесполезные части спектра. Щелкните по конечным длинам волн в спектре (нижняя левая плитка), введите новые значения (дополнительный рисунок 4) и нажмите Enter. Выберите диапазон длин волн, который удаляет зашумленные данные по краям окна. Для предоставленных данных диапазон составляет 340-680 нм.
8. Завершите настройку спектрального окна на нужный диапазон длин волн. Щелкните меню Surface , затем выберите Crop (дополнительный рисунок 5). Появится всплывающее окно.
   1. Нажмите кнопку ОК. Нажмите на меню «Файл », затем нажмите «Сохранить файл как». Затем нажмите кнопку ОК. Закройте этот набор данных.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны при кадрировании, так как функция обрезает данные как по оси длины волны, так и по оси задержки времени, удаляя все остальные данные. Убедитесь, что окно временной задержки содержит часть данных, которую необходимо сохранить. Кроме того, настоятельно рекомендуется сохранять все обрезанные данные в виде нового файла с соответствующей меткой, чтобы оставить поверхность необработанных данных нетронутой в качестве резервной копии.
9. Для данных, собранных на шкалах времени fs или ps, должна быть применена коррекция ЛЧМ. Откройте поверхность данных, используя только растворитель или подложку (без образца), взятые в той же экспериментальной установке, что и данные. Этот пример называется "пустым" запуском эксперимента. Выполните тот же набор шагов с «пустыми» данными (от шага 1.2 до шага 1.8), который был выполнен с образцом данных.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Настоятельно рекомендуется, чтобы такой «пустой» эксперимент проводился в тех же условиях, что и выборка, но с более коротким временным окном (например, от ~ −5 пс до 5 пс), чтобы обеспечить большое количество точек вокруг нулевого времени. Этот «холостой» прогон должен состоять только из растворителя или подложки, в зависимости от типа образца, и используется для установления кривизны ЛЧМ. Подготовка «заготовки» до этого момента должна следовать той же коррекции фона и обрезке, что и образцы данных. Если "пустой" не был запущен, коррекция ЛЧМ может быть выполнена непосредственно в наборе данных.
10. Запустите процесс коррекции чирпа. На плитке тепловой карты (вверху слева) нажмите на перекрестие и перетащите компонент вертикальной линии в синий конец спектра. Начните с синего диапазона длин волн в начале спектрального окна. Нажмите на меню Kinetics , затем нажмите Fit Solvent Response.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подгонка растворителя должна выполняться только на «пустом» образце, который не генерирует никаких сигналов после нулевого времени. Попытка применить эту функцию аппроксимации к набору данных, содержащему данные об интересующей молекуле или материале, приведет к тому, что программа попытается подогнать данные вместо IRF (функция отклика прибора). Для «пустых» выборок единственным присутствующим сигналом должен быть когерентный артефакт, возникающий в результате кросс-фазовой модуляции. Кросс-фазовая модуляция происходит только там, где лучи накачки и зонда перекрываются, и, следовательно, обеспечивает след кривизны ЛЧМ, который может быть подогнан с помощью опции "Fit Solvent Response" (Подгонка отклика растворителя). Ручная расстановка точек потребуется для данных без сопроводительного «пробела» для использования для исправления и более подробно описана в Дополнительном файле 3.
11. Откроется новое окно «Ответ на подгонку растворителя». Нажмите на кнопку Fit (дополнительный рисунок 6). Аппроксимация будет генерировать аппроксимацию функции отклика прибора, используя первую и вторую производные гауссова. Нажмите кнопку «Сохранить », затем нажмите «x », чтобы закрыть экран.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Красная аппроксимированная линия должна хорошо совпадать с точками данных (синие полые квадраты) во всем временном диапазоне, что наиболее важно, большой объект, наблюдаемый вблизи нулевого времени (0,1-2,0 пс). Аппроксимация будет иметь наибольший успех, если вокруг нулевого времени имеется большое количество точек, что может быть достигнуто за счет использования короткого временного окна задержки для «пустого» эксперимента и сохранения большого количества точек. Если аппроксимация не соответствует точкам данных, установите флажок "Добавить по Гауссу (R0)" и повторите попытку. Эта опция добавит сумму гауссова к первой и второй производным и может лучше соответствовать форме объекта IRF на этой длине волны. Если фитинг с откликом растворителя по-прежнему не может захватить сигнал IRF, выберите другую длину волны.
12. Выполните этот процесс (шаги 1.10-1.11) не менее пяти раз, так как для правильной коррекции чириканья потребуется пять баллов. Точки должны быть разнесены по всему спектральному окну, если это возможно. Некоторые растворители/подложки могут не генерировать наблюдаемый сигнал в частях спектрального окна, в зависимости от условий эксперимента. По мере необходимости можно добавлять/использовать дополнительные точки для обеспечения приемлемой посадки. По завершении закройте "пустой" набор данных.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая сохраненная точка записывается в файл Excel в рабочей папке в виде новой строки, как только пользователь нажимает кнопку Сохранить. Если нежелательная точка сохранена, ее можно удалить из файла Excel, удалив строку нежелательной точки.
13. Снова откройте обрезанный и фоновый набор данных. Щелкните меню Surface , затем выберите опцию Chirp Correction . Откроется новый экран с тремя окнами и меню в правом нижнем углу (дополнительный рисунок 7).
14. Добавьте только что созданную коррекцию ЧЧМ. Нажмите на опцию «Добавить из файла », выберите файл Excel, который заканчивается на «коэффициенты подгонки», и нажмите «ОК». Посадка ЛЧМ-коррекции теперь отображается в верхнем левом окне в виде черной линии с маркерами X (дополнительный рисунок 8).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Коррекция ЛЧМ отображается в виде сплошной линии; Маркеры X вдоль линии — это точки, сгенерированные в процессе отклика растворителя по размеру. Точки можно добавить вручную, настроив перекрестие и нажав на кнопку Добавить. Точки также можно удалить, выделив их и нажав кнопку Удалить. Другие точки можно отредактировать вручную, введя значения в список в правом нижнем углу. Наконец, при желании текущее исправление также можно сохранить в виде файла для последующего повторного использования с помощью кнопки Сохранить в файл .
15. Нажмите на кнопку Предварительный просмотр коррекции чирпа . При этом временно применяется коррекция ЧЧМ. Обратите внимание на коррекцию в верхнем левом окне, чтобы убедиться, что данные были сведены во времени и больше не наблюдается кривизны.
    1. Если вы удовлетворены коррекцией чирика, нажмите кнопку «Применить и выйти ». Если проблема не удовлетворена, повторите шаги 1.10-1.14, выбирая больше (или разные) длины волн для подгонки коррекции ЛЧМ, пока не будет получена удовлетворительная коррекция.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Применение коррекции ЛЧМ приведет к корректировке нулевого времени до выпрямленной линии, как она отображается в предварительном просмотре. Возможно некоторое временное несоответствие между «пустой» поверхностью и поверхностью данных.
16. Нажмите на меню «Файл», затем нажмите «Сохранить файл как». Введите соответствующее имя файла, чтобы указать, что была применена коррекция чирика. Затем нажмите кнопку ОК.
17. Некоторые объекты рассеяния в данных могут быть удалены не полностью при выполнении вычитания фона. Эти особенности влияют на подгонку и приводят к ошибочным результатам подгонки. Найдите все такие объекты в данных, которые должны быть удалены. Особенность рассеяния легче всего идентифицировать в отрицательной временной области.
    1. В левом верхнем углу плитки тепловой карты щелкните и перетащите перекрестие в область отрицательного времени. Оставаясь в пределах отрицательной временной области, используйте перекрестие для определения длин волн, на которых начинается и заканчивается особенность рассеяния. Обратите внимание на диапазон длин волн функции рассеяния (для предоставленного набора данных диапазон признаков составляет от 654 нм до 672 нм).
       ПРИМЕЧАНИЕ: При определении того, следует ли удалить объект, перетащите горизонтальное перекрестие вверх и вниз по осям времени, чтобы визуализировать спектральный диапазон объекта. Объекты рассеяния обычно имеют очень зашумленные одноволновые кинетические трассы, поэтому спектральный диапазон объекта также может быть проверен с помощью кинетических трасс.
18. Начиная с нижней (синей) длины волны (т.е. 654 нм), щелкните на правой длине волны в спектре (нижняя левая плитка) и введите значение нижнего (синего) экстента объекта.
19. Обрежьте данные, щелкнув меню «Поверхность », затем выберите «Обрезать». Нажмите OK во всплывающем меню. Сохраните обрезанные данные с уникальным именем файла, чтобы указать, на какой стороне данных они находятся (рекомендуется синяя или левая). Закройте файл.
20. Откройте файл с примененной коррекцией ЧЧМ, сохраненной на шаге 1.16. Перейдите к более высокому (красному) экстенту длины волны объекта. Щёлкните по левой длине волны в спектре (нижняя левая плитка) и введите значение более высокого экстента объекта.
21. Обрежьте данные, щелкнув меню «Поверхность », затем выберите «Обрезать». Нажмите OK во всплывающем меню. Сохраните обрезанные данные с уникальным именем файла, чтобы указать, на какой стороне данных находится (рекомендуется красная или правая).
22. Объедините два файла, щелкнув в меню Файл , затем выберите Объединить несколько поверхностей. В новом окне выберите обе стороны данных (например, Правую и Левую или Синюю и Красную). Используйте ctrl + щелчок , чтобы выбрать каждый файл. Убедитесь, что оба файла выбраны в поле «Имя файла:», затем нажмите «ОК» в правом нижнем углу. Когда индикатор выполнения завершится, данные будут объединены.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Таким образом можно объединить любое количество файлов. Данные могут быть сшиты в нескольких разрезах как по оси времени, так и по оси длины волны.
23. Нажмите на меню «Файл », затем нажмите «Сохранить файл как » и выберите уникальное имя файла, чтобы указать, что он объединен (рекомендуется «Комбинированный» или «Составной»). Затем нажмите OK , чтобы сохранить файл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В разделе 3 приведена информация о том, как сохранить данные из окна исходных данных для последующего отображения и построения графиков. Данные на тепловой карте (верхняя левая плитка) должны выглядеть, как показано на рисунке 3 , и теперь готовы к подгонке. Визуализация репрезентативных спектров, как показано на рисунке 3, описана на шаге 3.1.2.

2. Выполнение подгонки

1. Загрузите правильно подготовленную поверхность данных.
2. Решите, какая примерка будет выполнена, и переходите к соответствующему участку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе представлены два варианта аппроксимации данных: на шаге 2.3 представлена одноволновая подгонка кинетической трассировки, а на шаге 2.4 представлена аппроксимация по глобальному анализу.
3. Одноволновая подгонка
   1. Чтобы настроить одну кинетическую посадку, переместите курсор (в левом верхнем или нижнем углу) на нужную длину волны. Нажмите на меню «Кинетика », затем нажмите «Подогнать кинетику». Для предоставленного набора данных начните с 632 нм.
   2. В открывшемся новом окне (дополнительный рисунок 9) обратите внимание, что основные параметры аппроксимации и начальные значения заданы в левом верхнем углу окна под логотипом программы в поле рядом с этой областью под текстом "current fit @ wavelength".
   3. Нажмите на кнопки со стрелками , чтобы настроить количество жизней (т.е. количество экспоненциальных распадов, используемых для подгонки данных) в поле «Конечное время жизни». Для предоставленного набора данных выберите 2 времени жизни. В качестве отправной точки обычно используется от одной до 3 жизней.
   4. Если сигнал данных выходит за пределы собранного временного окна, должна быть включена «бесконечная» составляющая времени существования. Для этого нажмите на флажок Использовать бесконечное время жизни . Если данные полностью затухают до базового уровня, не устанавливайте этот флажок. Для предоставленного набора данных не устанавливайте флажок.
      ПРИМЕЧАНИЕ: "Бесконечное время жизни" позволяет сохранить смещение сигнала (т.е. программа не будет заставлять аппроксимацию затухать обратно к базовой линии). Использование бесконечной составляющей требуется в том случае, если сигнал на этой длине волны не затухает до базовой линии в пределах временного диапазона эксперимента.
   5. Введите предполагаемые значения для времени жизни и связанных с ним амплитуд, времени отклика прибора и нулевого времени, чтобы облегчить процесс подгонки (дополнительный рисунок 10). Нажмите на нужный параметр. Щелкните в окне значения, введите предполагаемое значение, а затем нажмите кнопку начального предположения , чтобы задать значение. Для предоставленного набора данных соответствующие значения приближения: 0 = 0 пс, IRF = 0,25 пс, A1 = 0,6, t1 = 100 пс, A2 = 0,08, t2 = 1100 пс.
      ПРИМЕЧАНИЕ: "0" - это оценка нулевого времени, "IRF" - время отклика прибора, "A" относится к амплитуде заданной экспоненциальной величины (см. уравнение 3), а "t" - постоянная времени жизни/времени. Предоставление правильных предположений помогает программе получить разумное соответствие. Выберите значения "A", которые находятся в пределах диапазона A в наборе данных. Выберите значения "t" для диапазонов времени, в которых наблюдаются значительные изменения в кинетической трассировке. Лучший способ получить интуитивное представление о том, как угадывание влияет на подгонку, — это попробовать несколько наборов угадывающих значений и понаблюдать за тем, как они совпадают. Если известен один или несколько из этих параметров, этот параметр можно установить и «зафиксировать» таким образом, чтобы он не изменялся в зависимости от подгонки (дополнительный рисунок 11).
   6. Когда все параметры предположения будут введены, нажмите на кнопку Fit . Репрезентативная аппроксимация показана на рисунке 4.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При применении аппроксимации график данных будет заполнен аппроксимированной линией и графиком невязок, которые можно использовать для оценки качества аппроксимации. Параметры аппроксимации, такие как время жизни и связанные с ним амплитуды, нулевое время и время отклика прибора, также заполняются в верхнем левом поле. Используйте несколько различных параметров аппроксимации для определения количества жизненных циклов и включения/исключения «бесконечного» компонента времени, который обеспечивает наилучшее соответствие данным.
   7. Сохраните посадку, нажав кнопку Save (дополнительный рисунок 9).
      ПРИМЕЧАНИЕ: В разделе 3 приведена информация о том, как сохранить данные из окна исходных данных для последующего отображения и построения графиков.
4. Подгонка для глобального анализа
   1. Щелкните меню Surface, затем выберите опцию Principal Components via SVD. Появится новое окно (дополнительный рисунок 12).
      ПРИМЕЧАНИЕ: В правом верхнем окне отображаются основные кинетические трассы, а в левом нижнем — основные спектры. В левом верхнем углу отображается график остаточной поверхности, созданной разницей между исходной поверхностью и поверхностью, созданной выбранными главными компонентами.
   2. Нажмите на кнопки со стрелками , чтобы установить «Количество главных компонентов» (дополнительный рисунок 12). Для предоставленного набора данных выберите 15.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При выборе числа главных компонентов один из способов состоит в том, чтобы продолжать увеличивать их число до тех пор, пока и главные спектры, и главные кинетические следы не станут похожи на шумовую картину. Еще один способ определить, сколько главных компонентов выбрать, — посмотреть на значения весовых коэффициентов, которые отображаются слева от условных обозначений в правом верхнем углу. Продолжайте добавлять главные компоненты до тех пор, пока это значение не достигнет 0,01. Как правило, для пущей убедительности рекомендуется добавить еще несколько. Это может привести к выбору до 15 или более основных компонентов.
   3. Нажмите на кнопку «Сохранить ». Сохраненные основные компоненты необходимы для перехода к следующему шагу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый главный компонент представляет собой упрощенное представление исходной поверхности данных. Использование главных компонентов приведет к упрощению поверхности по сравнению с анализируемыми исходными данными. Учет большинства основных характеристик поверхности данных очень важен для получения точной подгонки, поэтому важно использовать достаточное количество главных компонентов для захвата этих признаков. Использование большего количества основных компонентов не повредит посадке. Поэтому, если есть какие-либо сомнения по поводу того, сколько главных компонентов выбрать, используйте больше главных компонентов, а не меньше. Имейте в виду, что использование слишком большого количества может замедлить работу программного обеспечения для подгонки.
   4. После сохранения основных компонентов программа вернется на главный экран, и теперь можно попытаться выполнить глобальную подгонку. Щелкните меню «Surface », затем выберите опцию «Глобальная подгонка ». Откроется новое окно (дополнительный рисунок 13).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Основные кинетические трассы отображаются в правом верхнем углу. Верхняя левая плитка будет отображать поверхность подгонки по сравнению с исходной поверхностью. В левом нижнем углу будут отображаться спектры разности, связанные с распадом (DADS), сгенерированные подгонкой. Наконец, в правом нижнем углу можно задать параметры аппроксимации, в том числе количество экспоненциальных функций для использования и необходимость использования бесконечной функции.
   5. С помощью кнопок со стрелками рядом с пунктом «Количество эксп.» установите количество экспоненциальных функций, включаемых в подгонку. Если сигнал данных выходит за пределы собранного временного окна, должна быть включена «бесконечная» составляющая времени существования. Для этого установите флажок Use offset (Ainf). Для предоставленного набора данных выберите 2 и не устанавливайте флажок. Если данные полностью затухают до базового уровня, не устанавливайте этот флажок.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры аппроксимации можно исправить перед выполнением аппроксимации, щелкнув по столбцу метки в правом нижнем окне под глобальными коэффициентами подгонки. Метка станет красной и изменится на (фиксированный) индикатор на этикетке. Любое значение, введенное в поле справа, будет использоваться для этого параметра, а не свободно изменяться для подгонки. Следует соблюдать осторожность при фиксации значений для подгонки, так как это может повлиять на результаты подгонки.
   6. Нажмите на кнопку Fit. Прогресс подгонки будет отображаться с помощью небольшой полосы загрузки в центре экрана. По завершении выполнения подгонки окна будут заполнены данными из подгонки (рис. 5 и дополнительный рис. 14). Визуально изучите результаты примерки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Информация, полученная как от основной кинетической посадки, так и от DADS, используется для определения того, стоит ли сохранять посадку или она слишком плохая. Как правило, если аппроксимация основных трасс хорошо совпадает с данными, а на графике нет или очень мало объектов, аппроксимация может быть принята. Легко проверить несколько посадок, изменив количество жизней и/или установив/сняв флажок с кнопки "Use offset (Ainf)". Следует принять наилучшую посадку, полученную после проверки нескольких вариантов параметров фитинга.
   7. Нажмите на кнопку «Сохранить ». При этом отображаемая в данный момент подгонка будет сохранена вместе с данными в файле Excel.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Файл Excel сохраняется в том же расположении, что и набор данных. Если выполняются дополнительные аппроксимации, которые необходимо сохранить, они перезапишут любую предыдущую версию. Таким образом, прежде чем создавать и сохранять новую посадку, присвойте любой старой посадке уникальное имя. Параметры, сохраненные из аппроксимации, включают только нулевое время, IRF, время жизни и сопутствующие им DADS. Этот файл не содержит никакой информации о графике или аппроксимации к основным кинетическим трассам. Сохранение основных кинетических трасс описано на шаге 3.3. В шаге 3.0 приведена информация о том, как сохранить данные из окна необработанных данных для последующего отображения и построения графиков.

3. Извлечение необработанных данных и аппроксимов из программного обеспечения для построения графиков

ПРИМЕЧАНИЕ: Необработанные данные или аппроксимация, полученные в результате аппроксимации по одной длине волны или глобального анализа, могут быть экспортированы в файлы csv, которые можно открыть в ряде других программ.

1. Извлечение исходных данных для построения графиков
   1. Чтобы экспортировать тепловую карту набора данных, выберите меню Файл , затем выберите Экспорт в CSV (дополнительный рисунок 15). Откроется окно, нажмите OK , чтобы сохранить csv-файл в том же каталоге, что и файл данных, открытый с тем же именем, что и файл данных.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, необработанные данные можно экспортировать, щелкнув правой кнопкой мыши по окну тепловой карты и выбрав Экспорт данных в буфер обмена. Это позволит временно сохранить данные, чтобы их можно было вставить в программный документ по выбору пользователя. Вставьте данные в файл Excel, а затем сохраните их.
   2. Несколько спектров могут быть отображены в окне для сравнения или с целью построения рисунка. Перетащите горизонтальный курсор (на тепловой карте, вверху слева) в нужную точку времени. Нажмите Ctrl + S , чтобы выбрать спектр и сохранить его в спектральном окне (внизу слева). Добавьте столько временных точек, сколько необходимо, чтобы показать прогрессию данных (5-10 спектров), как показано на рисунке 3.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количество спектров, выбранных для представления данных, и временное расположение этих спектров могут сильно зависеть от конкретного образца и условий эксперимента. Приведенная выше рекомендация носит общий характер, но специфика эксперимента должна диктовать, на каких частях набора данных будет сделан акцент.
   3. Экспортируйте как данные, щелкнув правой кнопкой мыши по окну, содержащему спектры. Нажмите на опцию «Экспортировать данные в буфер обмена ». Данные временно сохраняются. Вставьте эти данные в нужный программный документ (например, Excel) и сохраните.
   4. Несколько кинетических трасс могут быть отображены в окне кинетики так же, как и в окне спектров. Перетащите вертикальный курсор (на тепловой карте, вверху слева) на нужную длину волны. Нажмите Ctrl + X , чтобы выбрать временную дорожку и сохранить ее в окне кинетики (вверху справа). Добавьте столько точек времени, сколько пожелаете. Это временно сохранит текущую кинетическую трассировку в окне.
   5. Экспортируйте как данные, щелкнув правой кнопкой мыши окно, содержащее кинетические трассы. Нажмите на опцию «Экспортировать данные в буфер обмена ». Данные временно сохраняются. Вставьте эти данные в нужный программный документ (например, Excel) и сохраните.
2. Извлечение данных из одноволновой аппроксимации для отображения
   1. Нажмите на меню Kinetics , затем нажмите на Fit Kinetic , чтобы открыть окно, содержащее подогнанные данные.
   2. Щелкните правой кнопкой мыши по окну посадки (т.е. по центральной плитке в окне с подгонкой). Нажмите « Экспортировать данные в буфер обмена». Это временно сохранит его, чтобы его можно было вставить в другое программное обеспечение.
      ПРИМЕЧАНИЕ: График невязок под данными аппроксимации не может быть экспортирован и вместо этого должен быть создан заново из данных аппроксимации. Аппроксимация экспортирует как необработанные данные, так и линию подгонки, которую затем можно использовать для воссоздания невязки. Невязка создается путем вычитания значения аппроксимации из данных в каждый момент времени и построения графика, аналогичного тому, который показан в окне "Кинетика подгонки".
   3. Вставьте эти данные в нужный программный документ (например, Excel) и сохраните.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Экспорт в буфер обмена будет включать только необработанные данные и данные линий подгонки для каждой экспоненциальной величины, используемой в подгонке. Параметры аппроксимации, такие как время жизни, амплитуды и т.д., не будут включены и должны быть экспортированы путем копирования значений из программного обеспечения для аппроксимации.
3. Извлечение данных из глобального анализа жизненного цикла для отображения и анализа
   1. Щелкните меню Surface, затем выберите опцию Global Fit, чтобы открыть окно, содержащее подогнанные данные.
   2. Точность значений осей оптической плотности и временной задержки/длины волны должна быть скорректирована для главных компонентов (верхняя правая плитка) и DADS (нижняя левая плитка) соответственно. Наведите курсор мыши на окно главного компонента до тех пор, пока в правом нижнем углу не появится окно настроек.
   3. Быстро нажмите кнопку x.xx , наведите курсор мыши на «Точность» и выберите 6 в меню, чтобы установить количество знаков после запятой.
   4. Наведите курсор мыши на окно главного компонента до тех пор, пока в правом нижнем углу не появится окно настроек. Быстро нажмите на кнопку y.yy, наведите курсор мыши на «Точность» и нажмите на 6 в меню, чтобы установить количество знаков после запятой для включения.
   5. Щелкните правой кнопкой мыши на окне Основные кинетические трассировки (Principal Kinetic Traces ). Нажмите « Экспортировать данные в буфер обмена». Это временно сохранит его, чтобы его можно было вставить в другое программное обеспечение.
   6. Вставьте эти данные в нужный программный документ (например, Excel) и сохраните.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Данные будут сохранены в виде последовательности столбцов, содержащих сначала временные задержки, затем основные кинетические трассы, за которыми следует линия подгонки. Для каждого главного компонента, выбранного при подготовке к глобальному анализу, будет по одному набору. Спектры DADS уже были сохранены в рамках процедуры аппроксимации на шаге 2.4.7.

Discussion

Общие рекомендации по подготовке данных
На первый взгляд может показаться, что подгонка данных ТА относительно проста, и можно ожидать, что для данного набора данных должен быть получен один четкий правильный «ответ». Однако, как подчеркивается в протоколе, существует множество факторов при сборе, подготовке и анализе данных, которые необходимо тщательно учитывать, что может привести к неопределенности в отношении того, какая модель или набор подходящих параметров лучше всего описывает данные. Цель подготовки и подгонки данных состоит в том, чтобы уменьшить как можно больше этих посторонних факторов, сохраняя при этом данные для анализа. Новичку эта задача может показаться сложной, так как нужно учитывать многое. Чтобы развить интуицию в отношении процесса подгонки, новичку рекомендуется попробовать подготовить одни и те же данные несколько раз с нуля немного разными способами, чтобы проверить, насколько сильно этапы подготовки данных влияют на наилучшее соответствие. Кроме того, два разных исследователя могут подготовить и сопоставить одни и те же данные и сравнить результаты. Этот процесс может занять много времени в первые несколько раз, однако это позволит новичку развить интуицию о том, как последовательно подготавливать данные для будущих образцов. Как и любой навык, эта подготовка и подгонка данных потребует времени для развития, и новичку рекомендуется быть терпеливым и дисциплинированным при экспериментах и изучении процесса. Набор данных, используемый в этом исследовании, предоставлен для того, чтобы дать новичку возможность вписаться непосредственно в учебник и напрямую сравнить результаты с теми, которые были получены в учебном пособии.

Данные могут содержать фоновые признаки , которые присутствуют при всех временных задержках (дополнительный рисунок 2 и дополнительный рисунок 3), такие как рассеяние пучка накачки и спонтанное излучение образца. Эти нежелательные признаки должны быть удалены для того, чтобы изолировать переходный сигнал поглощения от интересующего вида¹¹. Удаление таких признаков осуществляется путем выбора, усреднения и удаления вклада ряда спектров отрицательной разности во времени. При выборе фоновых спектров важно убедиться, что для удаления не включены объекты, которые могут быть частью интересующего процесса. Фоновые особенности, связанные с растворителем, такие как поглощение примесями или самим растворителем, также могут наблюдаться в данных ТА. Когда растворитель выдает сигнал, из образца набора данных необходимо вычесть «пустой» набор данных, содержащий только растворитель, работающий в тех же экспериментальных условиях, что и образец. Подробная информация об этой процедуре содержится в Дополнительном файле 3.

Коррекция чириканья — еще один фактор, который следует тщательно учитывать. ЛЧМ возникает, когда зондирующий импульс проходит к образцу и расширяется из-за дефектов рулевых зеркал или при прохождении через дисперсионную оптику, такую как линзы или фильтры. Конечным результатом является то, что фотоны более низких энергий в зондовом импульсе (т.е. в красной стороне зондового спектра) достигают образца раньше, чем фотоны более высоких энергий (т.е. синяя сторона зондового спектра). Это приводит к тому, что «нулевое время» спектров ТА размазывается в течение нескольких фемтосекунд или пикосекунд¹⁸, что проявляется в виде отчетливой кривой в необработанном наборе данных, начинающейся в синей длине волны и затем сглаживающейся по мере приближения к красной (дополнительный рисунок 7). Chirp наиболее заметен на более коротких временных масштабах, таких как те, к которым обращается сверхбыстрая TA. Это зависящее от длины волны нулевое время может быть скорректировано, как описано в протоколе, но применение этого процесса может быть сложным и субъективным. Наличие «пустого» образца или измерение отклика растворителя по шкале Керра может свести к минимуму субъективный характер ручного выбора точек для коррекции ЛЧМ, необходимой для создания полиномиальной аппроксимации, используемой для корректировки и коррекции ЛЧМ. Цель коррекции ЛЧМ состоит в том, чтобы удалить отчетливую «кривую» нулевого времени. Для получения наилучших данных, скорректированных с помощью ЧИРП, может потребоваться несколько попыток подгонки ЧМЧ. Данные могут быть подогнаны несколько раз с применением различных поправок ЛЧМ, чтобы получить представление о влиянии ЛЧМ-коррекции на значения короткого времени жизни ТА.

Артефакты, появляющиеся в «нулевое время»
В данных ТА можно наблюдать несколько артефактов, близких к «нулевому времени», включая рэлеевское рассеяние, вынужденное комбинационное рассеяние и кросс-фазовую модуляцию. Рэлеевское рассеяние пучка накачки — это упругое рассеяние, возникающее без изменения энергии. Эта функция будет появляться на той же длине волны, что и импульс накачки. Вынужденное комбинационное рассеяние может сопровождать сигнал рассеяния накачки¹⁹. Комбинационное рассеяние, возникающее в результате неупругого рассеяния фотона накачки, создает пики как с более высокой (антистоксовской), так и с более низкой (стокс) энергией, чем энергия падающей накачки. В данных ТА вынужденное комбинационное рассеяние наблюдается за счет одновременного облучения образца пучками накачки и зонда. Когда пучок зонда взаимодействует с образцом одновременно с пучком насоса, он стимулирует рамановский процесс. Таким образом, вынужденное комбинационное рассеяние происходит около нуля времени и приводит к дополнительным пикам в спектрах в течение первых нескольких сотен фемтосекунд (рис. 6, наблюдаемый в темно-синем спектре в выделенной области и дополнительный рисунок 17). Кросс-фазная модуляция возникает в результате модуляции показателя преломления растворителя от взаимодействия с интенсивным электрическим полем импульса.

Вынужденное комбинационное рассеяние можно отличить от кросс-фазовой модуляции, поскольку пики комбинационного рассеяния возникают на определенных частотах, соответствующих колебательным модам растворителя. Поскольку это рамановский процесс, можно наблюдать как стоксовские, так и антистоксовские линии по обе стороны возбуждения. Хлорированные растворители, такие как метиленхлорид, демонстрируют очень заметные комбинационные полосы из-за большой поляризуемости хлора. Спектральные сигнатуры кросс-фазовой модуляции уникальны для растворителя, но их не так легко предсказать, как особенности комбинационного рассеяния.

В зависимости от кинетики измеряемого образца рэлеевское рассеяние, комбинационное рассеяние и кросс-фазовая модуляция могут перекрываться с ранними характеристиками данных ТА, и их может быть трудно удалить из данных. В принципе, эти характеристики можно увидеть при аккуратном измерении растворителя и вычесть из данных, программы анализа данных могут иметь функции подгонки для учета этих особенностей, но на практике это может быть затруднительно. Если вычесть эти артефакты без ущерба для выборочных данных слишком сложно, возможно, лучше обрезать скомпрометированные спектры около нуля времени, чтобы устранить артефакты. Это приведет к неприятному побочному эффекту в виде удаления первых примерно 300 фс данных, но сделает подгонку более надежной в дальнейшем. В ходе анализа нескольких наборов данных из одной и той же и разных выборок, новичок приобретет интуицию в достижении этого баланса между вычитанием фоновой поверхности и обрезкой исходных данных размером 100-200 фс.

Общее кадрирование может потребоваться для частей спектров, содержащих низкое соотношение сигнал/шум. Нестабильность пучка зонда в определенных областях, низкая интенсивность света зонда, слишком высокие концентрации образца (тем самым блокирующие большую часть падающего зонда), низкая интенсивность накачки и сечение поглощения образца являются типичными причинами низкого соотношения сигнал/шум, что может затруднить подгонку данных. В этих случаях обрезка набора данных по обе стороны оптического окна для достижения желаемого уровня соотношения сигнал/шум может помочь процессу аппроксимации.

Набор данных готов к анализу после того, как он был достаточно обрезан, чтобы удалить плохие участки набора данных, исправлен ЧМР, а фоновые спектры усреднены и вычтены. В результате этой процедуры должны быть получены данные, содержащие только те части, которые наиболее важны для интересующей нас фотофизики и фотохимии. Действительно, очевидно, что в этом процессе есть некоторая доля субъективности. Цель подготовки данных состоит в том, чтобы найти баланс между удалением артефактов, чтобы они не мешали подгонке, но и не удалением настолько, чтобы это нарушало целостность набора данных, тем самым препятствуя его интерпретации. Чтобы найти этот баланс, требуется время и опыт, чтобы выработать интуицию относительно того, что является артефактом, а что — данными. Подгонка (и повторная подгонка) одного и того же набора данных в несколько разных дней или сопоставление двух исследователей с одними и теми же данными может быть способом свести к минимуму человеческий фактор и субъективность подготовки и анализа данных.

Общие соображения по подгонке и интерпретации
После того, как необработанные спектры ТА были обработаны, они должны быть интерпретированы и смоделированы для извлечения информации о видах и динамике, присутствующих в интересующей системе. Этот процесс можно описать как трехступенчатую процедуру, которая включает в себя первоначальную спектральную интерпретацию, количественное моделирование/аппроксимацию и присвоение спектральной интерпретации модели/подгонке.

Первоначальная спектральная интерпретация: На этапе спектральной интерпретации цель состоит в том, чтобы соотнести характеристики, присутствующие в спектрах ТА, с электронными состояниями, доступными в ходе фотофизической или фотохимической эволюции системы. Для начала следует выделить различные состояния. В данной работе под состояниями понимаются уникальные электронные состояния, которые являются частью фотофизической или фотохимической эволюции системы. Состояние, представленное, например, одной специфической кривой потенциальной энергии (УИК), обладает набором характерных пиков, представляющих его спектр поглощения. Изменение, происходящее в пределах одного состояния, называется процессом. Фотофизический процесс может проявляться в спектрах ТА в виде сдвига пика или изменения ширины спектра. Ключевым аспектом процесса является то, что численность населения штата остается неизменной (т.е. процесс происходит в рамках данной УИК); Меняется распределение энергии внутри состояния. Изменение численности населения штата будет называться переходным периодом. Во время перехода система эволюционирует в другой УИК (т.е. в электронное состояние). Переходы могут включать внутреннее преобразование (IC), межсистемное пересечение (ISC), перенос заряда, перенос энергии, образование новых продуктов или возврат в основное состояние. Рекомендации по назначению состояний, процессов и переходов обсуждаются в следующих параграфах.

Назначение состояний
Первый шаг в этом процессе включает в себя присвоение спектральных характеристик конкретным химическим веществам или состояниям. Состояние_S1 в ТА должно показывать время жизни, соответствующее времени жизни флуоресценции, полученному с помощью эмиссионной спектроскопии с временным разрешением. Триплетное состояние можно проверить, если время его жизни гасится кислородом. Если в фотофизической эволюции подозревается наличие радикального аниона или катиона, можно провести спектроэлектрохимию или химическое окисление/восстановление для получения радикальной формы, а также получить спектр поглощения этого вещества и сравнить его с формой полосы ТА. Спектроскопия электронного спинового резонанса (ESR) может быть выполнена для проверки наличия свободных радикалов. Превосходный учебный доклад, организованный Отделом неорганической химии ACS, дает обзор ТА и таких соображений при присвоении признаков²⁰. После того, как каналы присвоены видам, следующим шагом в интерпретации спектров ТА является качественное описание динамических процессов, происходящих в системе. Этот шаг жизненно важен, так как он дает исследователю представление о том, какие модели будут подходящими для описания его системы, и дает ему базовую линию для сравнения параметров подгонки.

Изменения внутри государства
Вибрационное охлаждение, геометрическая перестройка или сольватация являются чрезвычайно быстрыми процессами (от суб-пс до 10'с пс), которые можно наблюдать при ТА. Колебательное охлаждение наблюдается в виде быстрого синего сдвига спектра ТА на нескольких пикосекундных временных шкалах 21,22,23. Геометрическая перестановка может произойти на временной шкале 10 пс. В обычных дипольных жидкостях динамика сольватации наблюдается в виде красного смещения и сужения спектра в течение нескольких пикосекунд, но высоковязкие растворители, такие как глицерин, полиэтиленгликоль (ПЭГ), ионные жидкости и глубокие эвтектические растворители, могут проявлять динамику сольватации, протекающую в течение нескольких наносекунд 24,25,26.

Изменения численности населения штата
Реакции характеризуются изменением интенсивности полосы, где снижение интенсивности связано с уменьшением концентрации ее химических частиц и наоборот для увеличения. В некоторых случаях в спектрах видны как реагенты, так и продукты, в то время как в других состояниях продукты слишком короткоживущие или слишком сильно смещены в красное смещение, чтобы их можно было наблюдать. Часто переходы от состояния к состоянию можно наблюдать по наличию в спектрах изобестовой точки.

Количественное моделирование/подгонка: Модель должна быть подогнана к данным, чтобы извлечь количественную информацию о динамике системы. Как было описано ранее во введении, существует огромное количество моделей, которые можно использовать. Этот протокол фокусируется на двух наиболее распространенных методах: одноволновой аппроксимации и глобальном анализе. Одноволновый метод включает в себя подгонку отдельных трасс длин волн из спектров к некоторой функциональной форме, обычно к сумме экспоненциальных чисел:

(2)

где ΔA(t) – сигнал ТА на выбранной длине волны, n – число экспоненциальных составляющих, a_i– амплитуда экспоненциальной составляющей i, с постоянной времени τ_i. Можно добавлять несколько компонентов до тех пор, пока аппроксимация не воспроизведет экспериментальные данные. Цель любого процесса аппроксимации состоит в том, чтобы смоделировать данные, используя достаточное время жизни, чтобы хорошо воспроизвести данные, но не переусердствовать с данными, включая слишком много компонентов. Таким образом, взвешенные параметры пригодности к соответствию, такие как , используются для определения того, когда данные соответствуют экспериментальным неопределенностям⁵.

После того, как распад подогнан удовлетворительно, параметры модели могут быть использованы для характеристики динамики системы. Полученные константы времени могут быть извлечены и интерпретированы. К сожалению, большое количество перекрывающихся признаков в спектрах ТА означает, что одна длина волны в спектре может содержать динамику, соответствующую различным видам, чьи спектральные сигнатуры перекрываются, а это означает, что временные константы, извлеченные из одной длины волны, могут представлять собой совокупность нескольких совпадающих процессов. Кроме того, любые изменения в форме и положении полосы также будут влиять на амплитуды и константы времени, извлеченные из одноволновой аппроксимации. В некоторых случаях эти проблемы можно обойти с помощью подходящего метода, называемого «анализом формы полосы», при котором определяется или принимается функциональная форма для ТА-полос каждого поглощающего вида в системе. Затем эти формы взвешиваются по амплитудам, зависящим от времени, и суммируются вместе, чтобы воспроизвести наблюдаемый спектр. Эта процедура обычно используется при анализе спектров флуоресценции с временным разрешением, но более сложные формы и перекрывающиеся компоненты ТА-полос делают этот метод приемлемым только в нескольких простых случаях, как подробно описано в другом месте¹⁰.

Еще один недостаток одноволновой аппроксимации заключается в том, что она по своей сути не использует преимущества широкого спектрального диапазона, предоставляемого современными экспериментами ТА. В принципе, можно методично подогнать каждую отдельную длину волны спектра, но такой анализ громоздкий, трудоемкий и вычислительно затратный. Для решения этой проблемы может быть использован метод, называемый «глобальным анализом», для одновременной подгонки всего набора спектров ТА к набору общих динамических параметров⁴. Глобальный анализ и тесно связанный с ним метод, называемый целевым анализом, являются успешными и широко используемыми методами, но они также имеют свой уникальный набор недостатков и ограничений. Как и в случае с любой моделью, крайне важно понимать допущения, которые используются для ее создания, а также ограничения, которые они представляют.

В глобальном анализе спектры ТА представлены матрицей m на n, где m представляет количество длин волн, измеренных в каждом спектре, а n — количество собранных точек времени. Затем предполагается, что эта матрица разложима на произведение двух других матриц:

(3)

где C(t) — матрица n на k, а S(λ) — матрица m на k. Значение k представляет собой количество различных спектральных компонентов, используемых для воспроизведения спектров. Каждый из этих компонентов представляет собой поглощающий вид с уникальной спектральной сигнатурой и динамикой. Матрица S(λ) представляет собой спектры TA k-компонент и C(t) их концентраций, зависящих от времени. В простейшей и наиболее распространенной реализации глобального анализа предполагается, что каждый компонент имеет одноэкспоненциальную кинетику (i = 1 в уравнении 2, при этом каждому компоненту присваивается своя постоянная времени). Таким образом, полный спектр ТА может быть представлен суммой k компонент спектра, каждая из которых имеет свой характерный спектр поглощения и одиночный экспоненциальный спад.

Когда спектры ТА подогнаны, пользователь угадывает, сколько компонентов (т.е. значение для k) необходимо, и делает предположение о постоянной времени, связанной с одноэкспоненциальным распадом этих видов. Затем монтажник генерирует_{предположение} C(t) и решает уравнение 3 для_{S fit}(t). Затем S_fit(λ) и_{C guess}(t) перемножаются, как в уравнении 3, чтобы получить аппроксимированные спектры, ΔA(λ,t)_fit. Наконец, остатки ΔA(λ,t)_exp − A(λ,t)_fit минимизируются и возвращаются оптимальные_{S fit} (λ) и константы времени. Относительная простота глобального анализа, представляющего целый набор спектров с использованием нескольких временных констант и фиксированных спектральных компонентов, делает его привлекательным (и успешным) методом для распутывания сложных полосных форм и динамики, встречающихся в ТА-спектроскопии. Тем не менее, необходимо позаботиться о том, чтобы глобальный анализ был подходящей моделью для рассматриваемой системы.

Ключевым допущением глобального анализа, проиллюстрированным уравнением 3, является полная разделимость длины волны и временной части динамики, свойство, называемое «билинеарностью». Это предположение требует, чтобы формы полос компонентов не зависели от времени (т.е. они имели фиксированную спектральную форму, которая не изменяется и не смещается со временем). Единственное, что меняется в ходе эксперимента, — это относительные популяции каждого компонента, представленные C(t). На длительных временных масштабах, ~1 нс или около того, это предположение обычно выполняется, и глобальный анализ может быть использован без особых опасений. С другой стороны, процессы в возбужденном состоянии, такие как колебательное охлаждение и динамика сольватации, заметные на сверхбыстрых временных шкалах, доступных фемтосекундной ТА, приводят к зависящим от времени изменениям спектральной сигнатуры вида и нарушению билинейности. Это не означает, что глобальный анализ не может воспроизвести набор данных, на самом деле, он всегда может дать удовлетворительное соответствие при условии использования достаточного количества компонентов. Таким образом, проблема заключается в интерпретации спектров компонентов и присвоении временных констант конкретным процессам в возбужденном состоянии, поскольку компоненты могут больше не соответствовать отдельным поглощающим видам. Поэтому всегда следует проявлять осторожность при применении глобального анализа к ситуациям, когда билинейность не может быть допущена.

Назначение спектральной интерпретации модели/подгонки: После того, как аппроксимация получена, спектральная интерпретация должна быть сопоставлена с жизненными циклами, полученными в аппроксимации. Время жизни от аппроксимации присваивается как процессам, так и реакциям, которые были выявлены при первоначальной интерпретации спектров. Тем не менее, первоначальная оценка спектров и количество подогнанных времен жизни, полученных моделью, могут не сразу сопоставляться друг с другом. В этой (распространенной!) ситуации монтажнику необходимо вернуться назад и оценить первоначальную интерпретацию. Возможно, имело место вибрационное охлаждение или другой процесс, который был пропущен при первоначальной оценке, но был выявлен в процессе моделирования и подгонки. Или, возможно, два разных набора параметров подгонки могут хорошо воспроизводить данные, и первоначальная интерпретация может помочь определить, какой набор параметров соответствия выбрать. На этом заключительном этапе монтажник должен пройти взад и вперед между интерпретацией и подгонкой, чтобы найти описание, которое приведет к правдоподобному фотофизическому определению вида и динамики системы. Другие программы аппроксимации, включающие последовательные модели подгонки, такие как целевой анализ, также могут быть изучены в дополнение к аппроксимациям, полученным в результате глобального анализа и программного обеспечения для подгонки, представленного в этой статье⁴.

Таким образом, в настоящем протоколе обсуждается подготовка и подгонка данных о нестационарном поглощении. Его цель состоит в том, чтобы осветить проблемы, связанные с этим процессом, и прокомментировать способы избежать или смягчить эти проблемы на практике. Подгонка данных ТА, как и подгонка большинства данных, встречающихся в технических областях, может быть сложной и, иногда, субъективной. Поэтому крайне важно знать о процессе и ограничениях данных, их подготовке и математических инструментах, используемых для моделирования и придания значения данным. Ученые должны критически подходить к данным и моделированию.

Можно попытаться смягчить субъективность их припадков. Например, данные могут быть подготовлены и подогнаны из разных начальных точек и в разные дни, чтобы гарантировать одинаковое соответствие. Данные, полученные в разные дни с разной пробоподготовкой, можно сравнивать. Несколько исследователей могут сопоставить одни и те же данные и сравнить свои результаты. Со временем исследователи могут выработать интуицию относительно полученных данных (исходя из специфики их экспериментальной установки и параметров эксперимента), которая позволит им быть более уверенными в своих соответствиях.

В этой статье можно многое узнать о подгонке данных ТА и деталях моделей, обсуждаемых в этой статье. С энтузиазмом рекомендуется несколько отличных обзорных статей, которые глубоко углубляются в эту тему ^4,10,27. Этот протокол предназначен для начинающих в процесс анализа и подгонки, что стимулирует интерес к более глубокому пониманию процесса.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
EtOH 200% Proof	Decon Laboratories Inc	CAS 64-17-5	Solvent used to prepare Sample
Helios transient absorption spectrometer	Ultrafast systems	https://ultrafast.systems/products/spectrometers-accessories/helios/	Transient absorption spectrometer
POPOP  1,4-Bis[2-(5-phenyloxazolyl)]benzene	Tokyo Chemical Industry	CAS 1806-34-4	Sample used for Examples
Surface Xplorer	Ultrafast systems	https://ultrafast.systems/products/spectrometers-accessories/surface-xplorer/	Fitting program