Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מתאר הליך לבידוד שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות ממקרופאגים על ידי אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית וחילוץ הפפטידום לזיהוי באמצעות ספקטרומטריית מסות.

Abstract

שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות (sEVs) מופרשות בדרך כלל על ידי אקסוציטוזה של גופים רב-תאיים (MVB). ננו-שלפוחיות אלה בקוטר של <200 ננומטר נמצאות בנוזלי גוף שונים. כלי רכב חשמליים אלה מווסתים תהליכים ביולוגיים שונים כגון שעתוק ותרגום גנים, התרבות תאים והישרדותם, חסינות ודלקת באמצעות מטעניהם, כגון חלבונים, דנ"א, רנ"א ומטבוליטים. נכון לעכשיו, פותחו טכניקות שונות לבידוד sEVs. ביניהם, השיטה מבוססת אולטרה-צנטריפוגה נחשבת לתקן הזהב ונמצאת בשימוש נרחב לבידוד כלי רכב חשמליים. הפפטידים הם ביו-מקרומולקולות טבעיות עם אורך של פחות מ-50 חומצות אמינו. פפטידים אלה משתתפים במגוון תהליכים ביולוגיים בעלי פעילות ביולוגית, כגון הורמונים, מוליכים עצביים וגורמי גדילה של תאים. הפפטידום נועד לנתח באופן שיטתי פפטידים אנדוגניים בדגימות ביולוגיות ספציפיות על ידי ספקטרומטריית מסה כרומטוגרפית נוזלית (LC-MS/MS). כאן, הצגנו פרוטוקול לבידוד sEV על ידי אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית ופפטידום מופק לזיהוי על ידי LC-MS/MS. שיטה זו זיהתה מאות פפטידים שמקורם ב-sEV ממקרופאגים שמקורם במח עצם.

Introduction

שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות (sEVs) בקוטר של פחות מ-200 ננומטר נמצאות כמעט בכל סוגי נוזלי הגוף ומופרשות על ידי כל סוגי התאים, כולל שתן, זיעה, דמעות, נוזל מוחי ושדרתי ומי שפיר1. בתחילה, כלי רכב חשמליים נחשבו ככלי קיבול לסילוק פסולת סלולרית, מה שהוביל למחקר מינימלי בעשור שלאחר מכן2. לאחרונה, עדויות הולכות וגדלות מצביעות על כך שכלי רכב חשמליים מכילים חלבונים ספציפיים, שומנים, חומצות גרעין ומטבוליטים אחרים. מולקולות אלה מועברות לתאי מטרה3, התורמות לתקשורת בין-תאית, באמצעותה הן משתתפות בתהליכים ביולוגיים שונים, כגון תיקון רקמות, אנגיוגנזה, חסינות4 ודלקת5,6

Protocol

1. בידוד שלפוחיות חוץ תאיות קטנות

הערה: בצע את כל הצנטריפוגות בשלבים 1.1-1.11 ב- 4 ° C.

  1. הכנת סרום בקר עוברי ללא sEV (FBS): FBS צנטריפוגה למשך הלילה ב-110,000 × גרם ב-4°C באמצעות אולטרה-צנטריפוגה (ראה טבלת חומרים) להסרת sEV אנדוגניים. לאסוף את supernatant, לסנן לעקר אותו עם ?.......

Representative Results

עבור כלי רכב חשמליים שבודדו על-ידי אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית (איור 1), הערכנו את המורפולוגיה שלהם, את התפלגות גודל החלקיקים ואת סמני החלבונים שלהם לפי האגודה הבינלאומית לשלפוחיות חוץ-תאיות (ISEV)17.

ראשית, המורפולוגיה של כלי רכב חשמליים נצפתה על-.......

Discussion

כאשר חוקרים את תפקודם של כלי רכב חשמליים, הכרחי להשיג sEV בעלי טוהר גבוה מדגימות ביולוגיות מורכבות כדי למנוע זיהומים פוטנציאליים. 13 פותחו מגוון שיטות לבידוד כלי רכב חשמליים, ובין השיטות הללו, שיטות מבוססות אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית הראו טוהר גבוה יחסית של כלי רכב חשמליים. ב?.......

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי מענקים מהקרן למדעי הטבע של סין (3157270). אנו מודים לד"ר פנג שאו (המכון הלאומי למדעי הביולוגיה, סין) על מתן iBMDM.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
BCA Protein Assay KitBeyotime TechnologyP0012
CD9Beyotime TechnologyAF1192
Centrifugal filter tubeMilliporeUFC5010BK
Centrifuge bottles polypropyleneBeckman Coulter357003High-speed centrifuge
Chemiluminescent substrateThermo Fisher Scientific34580
DithiothreitolSolarbioD8220100 g
DMEM culture mediumCell WorldN?A
GRP94Cell Signaling Technology20292
High-speed centrifugeBeckman CoulterAvanti JXN-26Centrifuge rotor (JA-25.50)
Immortalized bone marrow-derived macrophages (iBMDM)National Institute of Biological Sciences, ChinaProvided by Dr. Feng Shao (National Institute of Biological Sciences, China)
IodoacetamideSigmal11495 g
Microfuge tube polypropyleneBeckman Coulter3574481.5 mL, Tabletop ultracentrifuge 
nano-high-performance LC systemThermo Fisher ScientificEASY-nLC 1000
Nanoparticle tracking analysis Malvern PanalyticalNanoSight LM10NanoSight NTA3.4
Orbitrap Q Exactive HF-X mass spectrometerThermo Fisher ScientificN/A
Phosphate-buffered salineSolarbioP1020
Polyallomer centrifuge tubesBeckman Coulter326823Ultracentrifuge
Protease inhibitorBimakeB14002
SpeedVac vacuum concentratorEppendorfConcentrator plus
Tabletop ultracentrifugeBeckman CoulterOptima MAX-XPUltracentrifuge rotor (TLA 55)
Transmission electron microscopeHITACHIH-7650B
TSG101SigmaAF8258
UltracentrifugeBeckman CoulterOptima XPN-100Ultracentrifuge rotor (SW32 Ti)
Ultrasonic cell disruptorScientzSCIENTZ-IID
Western Blot imagerBio-RadChemiDocXRsImage lab 4.0 (beta 7)
β-actinSigmaA3853

References

Explore More Articles

196

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved