Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

В этом протоколе описывается процедура выделения мелких внеклеточных везикул из макрофагов методом дифференциального ультрацентрифугирования и извлечения пептидома для идентификации с помощью масс-спектрометрии.

Abstract

Малые внеклеточные везикулы (sEV) обычно секретируются путем экзоцитоза мультивезикулярных телец (MVB). Эти нановезикулы диаметром <200 нм присутствуют в различных жидкостях организма. Эти sEV регулируют различные биологические процессы, такие как транскрипция и трансляция генов, пролиферация и выживание клеток, иммунитет и воспаление с помощью своих грузов, таких как белки, ДНК, РНК и метаболиты. В настоящее время разработаны различные методы выделения sEV. Среди них метод, основанный на ультрацентрифугировании, считается золотым стандартом и широко используется для выделения sEV. Пептиды представляют собой биомакромолекулы длиной менее 50 аминокислот. Эти пептиды участвуют в различных биологических процессах с биологической активностью, таких как гормоны, нейротрансмиттеры и факторы роста клеток. Пептидом предназначен для систематического анализа эндогенных пептидов в специфических биологических образцах методом жидкостной хромато-тандемной масс-спектрометрии (ЖХ-МС/МС). Здесь мы представили протокол для выделения sEV методом дифференциального ультрацентрифугирования и экстрагированного пептидома для идентификации с помощью ЖХ-МС/МС. Этот метод идентифицировал сотни пептидов, полученных из sEVs, из макрофагов, полученных из костного мозга.

Introduction

Небольшие внеклеточные везикулы (sEV) диаметром менее 200 нм присутствуют почти во всех типах жидкостей организма и секретируются всеми видами клеток, включая мочу, пот, слезы, спинномозговую жидкость и околоплодныеводы. Первоначально sEV рассматривались как контейнеры для утилизации клеточных отходов, что привело к минимальным исследованиям в последующеедесятилетие. В последнее время появляется все больше данных, указывающих на то, что sEV содержат специфические белки, липиды, нуклеиновые кислоты и другие метаболиты. Эти молекулы транспортируются к клеткам-мишеням3, способствуя межклеточной комму....

Protocol

1. Выделение мелких внеклеточных везикул

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте центрифугирование на этапах 1.1-1.11 при температуре 4 °C.

  1. Приготовление фетальной бычьей сыворотки без sEVs (FBS): центрифуга FBS в течение ночи при 110 000 × г при 4 °C через ультрацентрифугу (см. т?.......

Representative Results

Для sEV, выделенных с помощью дифференциального ультрацентрифугирования (рис. 1), мы оценили их морфологию, распределение частиц по размерам и белковые маркеры в соответствии с Международным обществом внеклеточных везикул (ISEV)17.

Во-первых, морф.......

Discussion

При исследовании функции sEV крайне важно получить sEV высокой чистоты из сложных биологических образцов, чтобы избежать любого потенциального загрязнения. Разработано множество методов выделенияsEV13, и среди этих методов методы, основанные на дифференциальном ультрацентри.......

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgements

Исследование выполнено при поддержке грантов Фонда естественных наук Китая (3157270). Благодарим д-ра Фэн Шао (Национальный институт биологических наук, Китай) за предоставление iBMDM.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
BCA Protein Assay KitBeyotime TechnologyP0012
CD9Beyotime TechnologyAF1192
Centrifugal filter tubeMilliporeUFC5010BK
Centrifuge bottles polypropyleneBeckman Coulter357003High-speed centrifuge
Chemiluminescent substrateThermo Fisher Scientific34580
DithiothreitolSolarbioD8220100 g
DMEM culture mediumCell WorldN?A
GRP94Cell Signaling Technology20292
High-speed centrifugeBeckman CoulterAvanti JXN-26Centrifuge rotor (JA-25.50)
Immortalized bone marrow-derived macrophages (iBMDM)National Institute of Biological Sciences, ChinaProvided by Dr. Feng Shao (National Institute of Biological Sciences, China)
IodoacetamideSigmal11495 g
Microfuge tube polypropyleneBeckman Coulter3574481.5 mL, Tabletop ultracentrifuge 
nano-high-performance LC systemThermo Fisher ScientificEASY-nLC 1000
Nanoparticle tracking analysis Malvern PanalyticalNanoSight LM10NanoSight NTA3.4
Orbitrap Q Exactive HF-X mass spectrometerThermo Fisher ScientificN/A
Phosphate-buffered salineSolarbioP1020
Polyallomer centrifuge tubesBeckman Coulter326823Ultracentrifuge
Protease inhibitorBimakeB14002
SpeedVac vacuum concentratorEppendorfConcentrator plus
Tabletop ultracentrifugeBeckman CoulterOptima MAX-XPUltracentrifuge rotor (TLA 55)
Transmission electron microscopeHITACHIH-7650B
TSG101SigmaAF8258
UltracentrifugeBeckman CoulterOptima XPN-100Ultracentrifuge rotor (SW32 Ti)
Ultrasonic cell disruptorScientzSCIENTZ-IID
Western Blot imagerBio-RadChemiDocXRsImage lab 4.0 (beta 7)
β-actinSigmaA3853

References

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

196

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved