A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
В этом протоколе описывается процедура выделения мелких внеклеточных везикул из макрофагов методом дифференциального ультрацентрифугирования и извлечения пептидома для идентификации с помощью масс-спектрометрии.
Малые внеклеточные везикулы (sEV) обычно секретируются путем экзоцитоза мультивезикулярных телец (MVB). Эти нановезикулы диаметром <200 нм присутствуют в различных жидкостях организма. Эти sEV регулируют различные биологические процессы, такие как транскрипция и трансляция генов, пролиферация и выживание клеток, иммунитет и воспаление с помощью своих грузов, таких как белки, ДНК, РНК и метаболиты. В настоящее время разработаны различные методы выделения sEV. Среди них метод, основанный на ультрацентрифугировании, считается золотым стандартом и широко используется для выделения sEV. Пептиды представляют собой биомакромолекулы длиной менее 50 аминокислот. Эти пептиды участвуют в различных биологических процессах с биологической активностью, таких как гормоны, нейротрансмиттеры и факторы роста клеток. Пептидом предназначен для систематического анализа эндогенных пептидов в специфических биологических образцах методом жидкостной хромато-тандемной масс-спектрометрии (ЖХ-МС/МС). Здесь мы представили протокол для выделения sEV методом дифференциального ультрацентрифугирования и экстрагированного пептидома для идентификации с помощью ЖХ-МС/МС. Этот метод идентифицировал сотни пептидов, полученных из sEVs, из макрофагов, полученных из костного мозга.
Небольшие внеклеточные везикулы (sEV) диаметром менее 200 нм присутствуют почти во всех типах жидкостей организма и секретируются всеми видами клеток, включая мочу, пот, слезы, спинномозговую жидкость и околоплодныеводы. Первоначально sEV рассматривались как контейнеры для утилизации клеточных отходов, что привело к минимальным исследованиям в последующеедесятилетие. В последнее время появляется все больше данных, указывающих на то, что sEV содержат специфические белки, липиды, нуклеиновые кислоты и другие метаболиты. Эти молекулы транспортируются к клеткам-мишеням3, способствуя межклеточной комму....
1. Выделение мелких внеклеточных везикул
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте центрифугирование на этапах 1.1-1.11 при температуре 4 °C.
Для sEV, выделенных с помощью дифференциального ультрацентрифугирования (рис. 1), мы оценили их морфологию, распределение частиц по размерам и белковые маркеры в соответствии с Международным обществом внеклеточных везикул (ISEV)17.
Во-первых, морф.......
При исследовании функции sEV крайне важно получить sEV высокой чистоты из сложных биологических образцов, чтобы избежать любого потенциального загрязнения. Разработано множество методов выделенияsEV13, и среди этих методов методы, основанные на дифференциальном ультрацентри.......
Исследование выполнено при поддержке грантов Фонда естественных наук Китая (3157270). Благодарим д-ра Фэн Шао (Национальный институт биологических наук, Китай) за предоставление iBMDM.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
BCA Protein Assay Kit | Beyotime Technology | P0012 | |
CD9 | Beyotime Technology | AF1192 | |
Centrifugal filter tube | Millipore | UFC5010BK | |
Centrifuge bottles polypropylene | Beckman Coulter | 357003 | High-speed centrifuge |
Chemiluminescent substrate | Thermo Fisher Scientific | 34580 | |
Dithiothreitol | Solarbio | D8220 | 100 g |
DMEM culture medium | Cell World | N?A | |
GRP94 | Cell Signaling Technology | 20292 | |
High-speed centrifuge | Beckman Coulter | Avanti JXN-26 | Centrifuge rotor (JA-25.50) |
Immortalized bone marrow-derived macrophages (iBMDM) | National Institute of Biological Sciences, China | Provided by Dr. Feng Shao (National Institute of Biological Sciences, China) | |
Iodoacetamide | Sigma | l1149 | 5 g |
Microfuge tube polypropylene | Beckman Coulter | 357448 | 1.5 mL, Tabletop ultracentrifuge |
nano-high-performance LC system | Thermo Fisher Scientific | EASY-nLC 1000 | |
Nanoparticle tracking analysis | Malvern Panalytical | NanoSight LM10 | NanoSight NTA3.4 |
Orbitrap Q Exactive HF-X mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
Phosphate-buffered saline | Solarbio | P1020 | |
Polyallomer centrifuge tubes | Beckman Coulter | 326823 | Ultracentrifuge |
Protease inhibitor | Bimake | B14002 | |
SpeedVac vacuum concentrator | Eppendorf | Concentrator plus | |
Tabletop ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima MAX-XP | Ultracentrifuge rotor (TLA 55) |
Transmission electron microscope | HITACHI | H-7650B | |
TSG101 | Sigma | AF8258 | |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima XPN-100 | Ultracentrifuge rotor (SW32 Ti) |
Ultrasonic cell disruptor | Scientz | SCIENTZ-IID | |
Western Blot imager | Bio-Rad | ChemiDocXRs | Image lab 4.0 (beta 7) |
β-actin | Sigma | A3853 |
Explore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved