Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

В этом протоколе описывается процедура выделения мелких внеклеточных везикул из макрофагов методом дифференциального ультрацентрифугирования и извлечения пептидома для идентификации с помощью масс-спектрометрии.

Abstract

Малые внеклеточные везикулы (sEV) обычно секретируются путем экзоцитоза мультивезикулярных телец (MVB). Эти нановезикулы диаметром <200 нм присутствуют в различных жидкостях организма. Эти sEV регулируют различные биологические процессы, такие как транскрипция и трансляция генов, пролиферация и выживание клеток, иммунитет и воспаление с помощью своих грузов, таких как белки, ДНК, РНК и метаболиты. В настоящее время разработаны различные методы выделения sEV. Среди них метод, основанный на ультрацентрифугировании, считается золотым стандартом и широко используется для выделения sEV. Пептиды представляют собой биомакромолекулы длиной менее 50 аминокислот. Эти пептиды участвуют в различных биологических процессах с биологической активностью, таких как гормоны, нейротрансмиттеры и факторы роста клеток. Пептидом предназначен для систематического анализа эндогенных пептидов в специфических биологических образцах методом жидкостной хромато-тандемной масс-спектрометрии (ЖХ-МС/МС). Здесь мы представили протокол для выделения sEV методом дифференциального ультрацентрифугирования и экстрагированного пептидома для идентификации с помощью ЖХ-МС/МС. Этот метод идентифицировал сотни пептидов, полученных из sEVs, из макрофагов, полученных из костного мозга.

Introduction

Небольшие внеклеточные везикулы (sEV) диаметром менее 200 нм присутствуют почти во всех типах жидкостей организма и секретируются всеми видами клеток, включая мочу, пот, слезы, спинномозговую жидкость и околоплодныеводы. Первоначально sEV рассматривались как контейнеры для утилизации клеточных отходов, что привело к минимальным исследованиям в последующеедесятилетие. В последнее время появляется все больше данных, указывающих на то, что sEV содержат специфические белки, липиды, нуклеиновые кислоты и другие метаболиты. Эти молекулы транспортируются к клеткам-мишеням3, способствуя межклеточной комму....

Protocol

1. Выделение мелких внеклеточных везикул

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте центрифугирование на этапах 1.1-1.11 при температуре 4 °C.

  1. Приготовление фетальной бычьей сыворотки без sEVs (FBS): центрифуга FBS в течение ночи при 110 000 × г при 4 °C через ультрацентрифугу (см. т?.......

Representative Results

Для sEV, выделенных с помощью дифференциального ультрацентрифугирования (рис. 1), мы оценили их морфологию, распределение частиц по размерам и белковые маркеры в соответствии с Международным обществом внеклеточных везикул (ISEV)17.

Во-первых, морф.......

Discussion

При исследовании функции sEV крайне важно получить sEV высокой чистоты из сложных биологических образцов, чтобы избежать любого потенциального загрязнения. Разработано множество методов выделенияsEV13, и среди этих методов методы, основанные на дифференциальном ультрацентри.......

Acknowledgements

Исследование выполнено при поддержке грантов Фонда естественных наук Китая (3157270). Благодарим д-ра Фэн Шао (Национальный институт биологических наук, Китай) за предоставление iBMDM.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
BCA Protein Assay KitBeyotime TechnologyP0012
CD9Beyotime TechnologyAF1192
Centrifugal filter tubeMilliporeUFC5010BK
Centrifuge bottles polypropyleneBeckman Coulter357003High-speed centrifuge
Chemiluminescent substrateThermo Fisher Scientific34580
DithiothreitolSolarbioD8220100 g
DMEM culture mediumCell WorldN?A
GRP94Cell Signaling Technology20292
High-speed centrifugeBeckman CoulterAvanti JXN-26Centrifuge rotor (JA-25.50)
Immortalized bone marrow-derived macrophages (iBMDM)National Institute of Biological Sciences, ChinaProvided by Dr. Feng Shao (National Institute of Biological Sciences, China)
IodoacetamideSigmal11495 g
Microfuge tube polypropyleneBeckman Coulter3574481.5 mL, Tabletop ultracentrifuge 
nano-high-performance LC systemThermo Fisher ScientificEASY-nLC 1000
Nanoparticle tracking analysis Malvern PanalyticalNanoSight LM10NanoSight NTA3.4
Orbitrap Q Exactive HF-X mass spectrometerThermo Fisher ScientificN/A
Phosphate-buffered salineSolarbioP1020
Polyallomer centrifuge tubesBeckman Coulter326823Ultracentrifuge
Protease inhibitorBimakeB14002
SpeedVac vacuum concentratorEppendorfConcentrator plus
Tabletop ultracentrifugeBeckman CoulterOptima MAX-XPUltracentrifuge rotor (TLA 55)
Transmission electron microscopeHITACHIH-7650B
TSG101SigmaAF8258
UltracentrifugeBeckman CoulterOptima XPN-100Ultracentrifuge rotor (SW32 Ti)
Ultrasonic cell disruptorScientzSCIENTZ-IID
Western Blot imagerBio-RadChemiDocXRsImage lab 4.0 (beta 7)
β-actinSigmaA3853

References

Explore More Articles

196

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved