עבודה זו נתמכה על ידי המכון לביולוגיה מולקולרית, האקדמיה סיניקה והמועצה הלאומית למדע וטכנולוגיה, טייוואן. חנות המכונות במכון לפיזיקה, אקדמיה סיניקה סייעה לייצר חלקים שתוכננו בהתאמה אישית. אנו גם רוצים להודות לפ. ארגסט (מכון פרידריך מיישר למחקר ביו-רפואי, בזל, שוויץ) על תכנון מנגנון הנעילה המהירה של שלב הראש.

כל ההליכים בבעלי חיים אושרו ובוצעו בהתאם להנחיות הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של האקדמיה סיניקה. פירוט כלי המחקר ניתן למצוא בטבלת החומרים.
1. הכנת תא הקלטה
<ol><li>הכינו מכל חצי משושה, פלטת בסיס ובמת ראש (איור 1A; קבצים משלימים 1-3...

מעקב אחר התנהגות ודפוס פעילות עצבית במוח הקדמי של דגי הזברה

<ol>
	<li>Grienberger, C., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+calcium+in+neurons.">Imaging calcium in neurons.</a> Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).</li><li>Chow, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+three-photon+imaging+of+the+brain+in+intact+adult+zebrafish.">Deep three-photon imaging of the brain in intact adult zebrafish.</a> Nature Methods. 17 (6), 605-608 (2020).</li><li>Mittmann, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+calcium+imaging+of+evoked+activity+from+L5+somatosensory+neurons+in+vivo.">Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo.</a> Nature Neuroscience. 14 (8), 1089-1093 (2011).</li><li>Friedrich, R. W., Jacobson, G. A., Zhu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circuit+neuroscience+in+zebrafish.">Circuit neuroscience in zebrafish.</a> Current Biology. 20 (8), R371-R381 (2010).</li><li>Kappel, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+recognition+of+social+signals+by+a+tectothalamic+neural+circuit.">Visual recognition of social signals by a tectothalamic neural circuit.</a> Nature. 608 (7921), 146-152 (2022).</li><li>Bartoszek, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ongoing+habenular+activity+is+driven+by+forebrain+networks+and+modulated+by+olfactory+stimuli.">Ongoing habenular activity is driven by forebrain networks and modulated by olfactory stimuli.</a> Current Biology. 31 (17), 3861-3874 (2021).</li><li>Valente, A., Huang, K. H., Portugues, R., Engert, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ontogeny+of+classical+and+operant+learning+behaviors+in+zebrafish.">Ontogeny of classical and operant learning behaviors in zebrafish.</a> Learning &amp; Memory. 19 (4), 170-177 (2012).</li><li>Buske, C., Gerlai, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+shoaling+behavior+is+accompanied+by+changes+in+the+dopaminergic+and+serotoninergic+systems+in+zebrafish.">Maturation of shoaling behavior is accompanied by changes in the dopaminergic and serotoninergic systems in zebrafish.</a> Developmental Psychobiology. 54 (1), 28-35 (2012).</li><li>Huang, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+virtual+reality+system+to+analyze+neural+activity+and+behavior+in+adult+zebrafish.">A virtual reality system to analyze neural activity and behavior in adult zebrafish.</a> Nature Methods. 17 (3), 343-351 (2020).</li><li>Rupprecht, P., Prendergast, A., Wyart, C., Friedrich, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+z-scanning+with+a+macroscopic+voice+coil+motor+for+fast+3D+multiphoton+laser+scanning+microscopy.">Remote z-scanning with a macroscopic voice coil motor for fast 3D multiphoton laser scanning microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 7 (5), 1656-1671 (2016).</li><li>Papadopoulos, I. N., Jouhanneau, J. -. S., Poulet, J. F. A., Judkewitz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scattering+compensation+by+focus+scanning+holographic+aberration+probing+(F-SHARP).">Scattering compensation by focus scanning holographic aberration probing (F-SHARP).</a> Nature Photonics. 11 (2), 116-123 (2017).</li><li>Torigoe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+capable+of+generating+future+state+prediction+error+show+improved+active+avoidance+behavior+in+virtual+reality.">Zebrafish capable of generating future state prediction error show improved active avoidance behavior in virtual reality.</a> Nature Communications. 12 (1), 5712 (2021).</li></ol>

במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול מפורט לריסון ראשם של דגי זברה בוגרים לצורך הדמיית סידן של שני פוטונים. ישנם שני שלבים קריטיים להשגת משענת ראש יציבה מספיק להדמיית סריקת לייזר. ראשית, מוט הראש צריך להיות מודבק לאתרי החיבור הספציפיים של הגולגולות. חלקים אחרים של הגולגולת הם לעתים קרובות דקים מכ?...

הדמיית סידן פלואורסצנטי עם אינדיקטורים מקודדים גנטית או צבעים סינתטיים הייתה שיטה רבת עוצמה למדידת פעילות עצבית בבעלי חיים מתנהגים, כולל פרימטים לא אנושיים, מכרסמים, ציפורים וחרקים1. את פעילותם של מאות תאים, עד כ-800 מיקרומטר מתחת לפני השטח של המוח, ניתן למדוד בו זמנית באמצעות דימות רב-פוטוני 2,3. ניתן למדוד את פעילותם של סוגי תאים מסוימים גם על ידי ביטוי מדדי סידן באוכלוסיות נוירונים מוגדרות גנטית. יישום שיטת ההדמיה עבור מודלים קטנים של בעלי חוליות פותח אפשרויות חדשות בתחום החישוב העצבי על פני אזורי מוח.
דגי זברה הם מערכת מודל נפוצה במחקר מדעי המוח. דגי זברה זחלים בסביבות 6 ימים לאחר ההפריה שימשו להדמיית סידן בשל מוחם המיניאטורי וגופם השקוף4. דגי זברה צעירים (בני 3-4 שבועות) משמשים גם לחקר המנגנונים העצביים העומדים בבסיס מסלולים סנסומוטוריים 5,6. עם זאת, רמת הביצוע המקסימלית עבור התנהגויות מורכבות, כולל למידה אסוציאטיבית והתנהגויות חברתיות, מושגת בגיל מבוגר יותר 7,8. לפיכך, נדרש פרוטוקול אמין כדי לחקור תפקודים קוגניטיביים מרובים במוחם של דגי זברה בוגרים באמצעות שיטות הדמיה. בעוד שזחלי זברה ודגי זברה צעירים יכולים להיות מוטמעים באגרוז להדמיית in vivo, דגי זברה בוגרים בגיל חודשיים ומעלה סובלים מהיפוקסיה בתנאים כאלה והם חזקים מדי פיזית מכדי להיות מרוסנים על ידי אגרוז. לכן, נדרש הליך כירורגי כדי לייצב את המוח ולאפשר לבעל החיים לנשום בחופשיות דרך הזימים.
כאן, אנו מתארים פרוטוקול ריסון ראש הכולל עיצוב חדשני של מוט ראש יחיד. זמן הניתוח המופחת של 25 דקות מהיר פי שניים מהשיטההקודמת 9. אנו מתארים גם את העיצוב של תא ההקלטה (מיכל חצי משושה), שלב הראש ומנגנון נעילה מהירה לשילוב שני החלקים9. לבסוף, מתואר גם המערך להצגת גירוי חזותי סוחף לחקר פעילות והתנהגויות מוחיות המופעלות על ידי ראייה. באופן כללי, ההליכים המתוארים כאן יכולים לשמש לביצוע דימות סידן של שני פוטונים באוכלוסיות תאים מוגדרות גנטית בדג זברה בוגר מרוסן ראש, המאפשר לחקור פעילויות מוחיות במהלך פרדיגמות התנהגותיות שונות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acquisition card</td>
			<td>MBF Bioscience</td>
			<td>Vidrio vDAQ</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Back-projection film</td>
			<td>Kimoto</td>
			<td>Diland screen - GSK</td>
			<td>present visual stimulus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band-pass filter (510/80 nm)</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET510/80m</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Base plate for the semi-hexagonal tank</td>
			<td>custom made</td>
			<td>see supplemental files</td>
			<td>recording chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera filter (&#60;875 nm)</td>
			<td>Edmund optics</td>
			<td>#86-106</td>
			<td>Behavior recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera filter (&#62;700 nm)</td>
			<td>Edmund optics</td>
			<td>#43-949</td>
			<td>Behavior recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MVL50M23</td>
			<td>Behavior recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chameleon Vision-S</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>Vision-S</td>
			<td>Laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circular plate for the head stage</td>
			<td>custom made</td>
			<td>see supplemental files</td>
			<td>recording chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Controller for piezo actuator</td>
			<td>Physik Instrumente&#160;</td>
			<td>E-665. CR</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Current amplifier</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TIA60</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elitedent Q-6</td>
			<td>Rolence Enterprise</td>
			<td>Q-6</td>
			<td>Surgery: UV lamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission Filter 510/80 nm</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET510/80m</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head bar</td>
			<td>custom made</td>
			<td>see supplemental files</td>
			<td>recording chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infrared light</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>M810L3</td>
			<td>Behavior recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED projector</td>
			<td>AAXA</td>
			<td>P2B LED Pico Projector</td>
			<td>present visual stimulus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moist paper tissue (Kimwipe)</td>
			<td>Kimtech Science</td>
			<td>34155</td>
			<td>Surgery: moist paper tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized XY sample stage</td>
			<td>Zaber</td>
			<td>X-LRM050</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral Density Filters (50% Transmission)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>NE203B</td>
			<td>present visual stimulus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#216;1/2&#34; Post Holder</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>PH1.5V</td>
			<td>Surgery: hollow tube for cannon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#216;1/2&#34; Stainless Steel Optical Post</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>TR150/M</td>
			<td>Surgery: fish loading module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens 16x, 0.8NA</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>CF175</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil-based modeling clay</td>
			<td>Ly Hsin Clay</td>
			<td>C4086</td>
			<td>Surgery: head bar holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical adhesive</td>
			<td>Norland Products</td>
			<td>NOA68</td>
			<td>Surgery: UV curable glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photomultiplier tube</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>H11706P-40</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piezo actuator</td>
			<td>Physik Instrumente&#160;</td>
			<td>P-725.4CA PIFOC</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pockels Cell</td>
			<td>Conoptics</td>
			<td>M350-80-LA-BK-02</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Wratten filter (&#62; 600 nm)</td>
			<td>Edmund optics</td>
			<td>#53-699</td>
			<td>present visual stimulus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resonant-Galvo Scan System</td>
			<td>INSS</td>
			<td>RGE-02</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right-Angle Clamp for &#216;1/2&#34; Post</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>RA90/M</td>
			<td>Surgery: fish loading module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotating Clamp for &#216;1/2&#34; Post</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>SWC/M</td>
			<td>Surgery: fish loading module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ScanImage</td>
			<td>MBF Bioscience</td>
			<td>Basic version</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semi-hexagonal tank</td>
			<td>custom made</td>
			<td>see supplemental files</td>
			<td>recording chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super-Bond C&#38;B Kit</td>
			<td>Sun Medical Co.</td>
			<td>Super-Bond C&#38;B</td>
			<td>Surgery: dental cement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine methanesulfonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td>Surgery: anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB Camera</td>
			<td>FLIR</td>
			<td>BFS-U3-13Y3M-C</td>
			<td>Behavior recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond</td>
			<td>3M</td>
			<td>1469SB</td>
			<td>Surgery: tissue glue</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two-photon calcium imaging of forebrain activity in behaving adult zebrafish

דגי זברה בוגרים (Danio rerio) מפגינים רפרטואר עשיר של התנהגויות לחקר תפקודים קוגניטיביים. יש להם גם מוח מיניאטורי שיכול לשמש למדידת פעילויות בין אזורי מוח באמצעות שיטות הדמיה אופטית. עם זאת, דיווחים על רישום פעילות מוחית בדגי זברה בוגרים היו נדירים. המחקר הנוכחי מתאר הליכים לביצוע הדמיית סידן של שני פוטונים במוח הקדמי הגבי של דגי זברה בוגרים. אנו מתמקדים בצעדים לריסון דגי זברה בוגרים מלהזיז את ראשם, מה שמספק יציבות המאפשרת הדמיה בלייזר של פעילות המוח. בעלי החיים המרוסנים לראש יכולים להזיז בחופשיות את חלקי גופם ולנשום ללא עזרים. מטרת ההליך היא לקצר את זמן ניתוח ריסון הראש, למזער את תנועת המוח ולמקסם את מספר תאי העצב שנרשמו. כאן מתוארת גם הגדרה להצגת סביבה חזותית אימרסיבית במהלך הדמיית סידן, שניתן להשתמש בה כדי לחקור קורלציות עצביות העומדות בבסיס התנהגויות המופעלות על ידי ראייה.

Calcium fluorescence imaging with genetically encoded indicators or synthetic dyes has been a powerful method of measuring neuronal activity in behaving animals, including non-human primates, rodents, birds, and insects1. The activity of hundreds of cells, up to approximately 800 &#181;m below the brain surface, can be measured simultaneously using multi-photon imaging2,3. The activity of specific cell types can also be measured by expressing calcium indicators in genetically defined neuronal populations. Application of the imaging method for small vertebrate models opens up new possibilities in the field of neuronal computation across brain regions.
Zebrafish are a widely used model system in neuroscience research. Larval zebrafish at around 6 days post-fertilization have been used for calcium imaging due to their miniature brain and transparent body4. Juvenile zebrafish (3-4 weeks old) are also used for studying the neural mechanisms underlying sensorimotor pathways5,6. However, the maximal performance level for complex behaviors, including associative learning and social behaviors, is reached at an older age7,8. Thus, a reliable protocol is required to study multiple cognitive functions in the brains of adult zebrafish using imaging methods. While zebrafish larva and juvenile zebrafish can be embedded in agarose for in vivo imaging, adult zebrafish at 2 months or older suffer from hypoxia in such conditions and are physically too strong to be restrained by agarose. Therefore, a surgical procedure is required to stabilize the brain and enable the animal to breathe freely through the gills. 
Here, we describe a head restraint protocol that involves a novel design of a single head bar. The reduced surgery time of 25 min is twice as fast as the previous method9. We also describe the design of the recording chamber (semi-hexagonal tank), the head stage and a quick-lock mechanism to combine the two parts9. Finally, the setup to present an immersive visual stimulus to study visually triggered brain activity and behaviors is also described. Overall, the procedures described here can be used to perform two-photon calcium imaging in genetically defined cell populations in a head-restrained adult zebrafish, enabling the investigation of brain activities during various behavioral paradigms.

מחבר זרקור: התקדמות בחקר המוח של דגי זברה בוגרים 

הדמיית סידן דו-פוטון של פעילות המוח הקדמי בדגי זברה בוגרים

The fish fore-brain hosts areas suspected to be homologous to mammalian brain regions involved in complex behavior. These include the hippocampus, the cortex, and the amygdala. We are currently trying to understand the effect of sensory information on the activity of these brain regions.Current research in zebra fish neuroscience uses two photon calcium imaging of immobilized larvae. Combined with virtual reality based behavior essays, to study sensory motor processing in the brain. Most research on the zebra fish brain is done on larvae, however some complex behaviors in fish do not fully develop until adulthood.Our protocol allows the study of brain activity in the adult during behavior. This protocol reduced surgery times by fifty percent compared to the previous method. It's a more efficient approach for restraining the head of adult zebra fish for a better image.This head restraint protocol opened an opportunity to perform an in vivo experiment on the adult zebra fish brain. In addition to the two-photon calcium image, head restraint potentially allows the opto-genetic manipulation, electro-physiology, and even ultra-sound imaging of live fish.

הפרוטוקול מורכב משני חלקים: ניתוח ריסון ראש והדמיית סידן בשני פוטונים של פעילות עצבית במוח הקדמי. הצלחת הניתוח מוגדרת על ידי הישרדות החיה ויציבות ריסון הראש. ניתן לשפר מאוד את שיעור ההישרדות על ידי זילוח תכוף של תמיסת TMS 0.01% דרך הפה במהלך הניתוח. דגים צריכים להתאושש מהרדמה ולנשום באופן פעיל...

Watch this Scientific Journal Video about Advancements in Adult Zebrafish Brain Research at JoVE.com

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לביצוע הדמיית סידן של שני פוטונים במוח הקדמי הגבי של דגי זברה בוגרים.

Adult zebrafish (Danio rerio) exhibit a rich repertoire of behaviors for studying cognitive functions. They also have a miniature brain that can be used ...

המוח הקדמי של הדג מארח אזורים החשודים כהומולוגיים לאזורי מוח של יונקים המעורבים בהתנהגות מורכבת. אלה כוללים את ההיפוקמפוס, קליפת המוח והאמיגדלה. כיום אנו מנסים להבין את ההשפעה של מידע חושי על הפעילות של אזורי המוח האלה.המחקר הנוכחי במדעי המוח של דגי זברה משתמש בשני דימות סידן פוטונים של זחלים משותקים. בשילוב עם מאמרי התנהגות מבוססי מציאות מדומה, כדי לחקור עיבוד מוטורי חושי במוח. רוב המחקר על מוח דג הזברה נעשה על זחלים, אולם כמה התנהגויות מורכבות בדגים אינן מתפתחות במלואן עד לבגרות.הפרוטוקול שלנו מאפשר לחקור את פעילות המוח אצל המבוגר במהלך ההתנהגות. פרוטוקול זה קיצר את זמני הניתוח בחמישים אחוז בהשוואה לשיטה הקודמת. זוהי גישה יעילה יותר לריסון ראשו של דג זברה בוגר לקבלת תמונה טובה יותר.פרוטוקול ריסון ראש זה פתח הזדמנות לבצע ניסוי in vivo על מוח דג הזברה הבוגר. בנוסף לתמונת הסידן של שני פוטונים, ריסון הראש מאפשר מניפולציה אופטו-גנטית, אלקטרו-פיזיולוגיה ואפילו הדמיית אולטרסאונד של דגים חיים.

הדמיית סידן דו-פוטון של פעילות המוח הקדמי בדגי זברה בוגרים

Abstract