Imagem de cálcio de dois fótons da atividade do prosencéfalo em peixes-zebra adultos com comportamento

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para realizar imagens de cálcio de dois fótons no prosencéfalo dorsal de zebrafish adultos.

Abstract

O peixe-zebra adulto (Danio rerio) exibe um rico repertório de comportamentos para o estudo das funções cognitivas. Eles também têm um cérebro em miniatura que pode ser usado para medir atividades em regiões cerebrais por meio de métodos de imagem óptica. No entanto, relatos sobre o registro da atividade cerebral em peixes-zebra adultos têm sido escassos. O presente estudo descreve procedimentos para a realização de imagens de cálcio de dois fótons no prosencéfalo dorsal de zebrafish adultos. Nós nos concentramos em etapas para impedir que peixes-zebra adultos movam suas cabeças, o que fornece estabilidade que permite imagens de varredura a laser da atividade cerebral. Os animais com a cabeça contida podem mover livremente suas partes do corpo e respirar sem ajudas. O procedimento visa encurtar o tempo da cirurgia de apoio de cabeça, minimizar o movimento cerebral e maximizar o número de neurônios registrados. Uma configuração para apresentar um ambiente visual imersivo durante a imagem de cálcio também é descrita aqui, que pode ser usada para estudar correlatos neurais subjacentes a comportamentos desencadeados visualmente.

Introduction

A imagem por fluorescência do cálcio com indicadores codificados geneticamente ou corantes sintéticos tem sido um poderoso método de medir a atividade neuronal em animais com comportamento, incluindo primatas não humanos, roedores, aves e insetos¹. A atividade de centenas de células, até aproximadamente 800 μm abaixo da superfície cerebral, pode ser medida simultaneamente por meio de imagens com múltiplos fótons ^2,3. A atividade de tipos celulares específicos também pode ser medida pela expressão de indicadores de cálcio em populações neuronais geneticamente definidas. A aplicação do mé....

Protocol

Todos os procedimentos com animais foram aprovados e realizados de acordo com as diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Academia Sinica. Detalhes dos instrumentos de pesquisa podem ser encontrados na Tabela de Materiais.

1. Preparação da câmara de gravação

1. Prepare um tanque semi-hexagonal, uma placa de base e um estágio de cabeça (Figura 1A; Arquivos complementares 1-3.......

Discussion

Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para conter a cabeça de peixes-zebra adultos para imagens de cálcio de dois fótons. Há duas etapas críticas para obter um apoio de cabeça que seja estável o suficiente para imagens de varredura a laser. Primeiro, a barra da cabeça deve ser colada nos locais de fixação específicos dos crânios. Outras partes do crânio são muitas vezes muito finas para fornecer estabilidade mecânica e podem até ser fraturadas durante movimentos fortes do corpo. Em segundo lugar, a pel.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acquisition card	MBF Bioscience	Vidrio vDAQ	Microscope
Back-projection film	Kimoto	Diland screen - GSK	present visual stimulus
Band-pass filter (510/80 nm)	Chroma	ET510/80m	Microscope
Base plate for the semi-hexagonal tank	custom made	see supplemental files	recording chamber
Camera filter (<875 nm)	Edmund optics	#86-106	Behavior recording
Camera filter (>700 nm)	Edmund optics	#43-949	Behavior recording
Camera lens	Thorlabs	MVL50M23	Behavior recording
Chameleon Vision-S	Coherent	Vision-S	Laser
Circular plate for the head stage	custom made	see supplemental files	recording chamber
Controller for piezo actuator	Physik Instrumente	E-665. CR	Microscope
Current amplifier	Thorlabs	TIA60	Microscope
Elitedent Q-6	Rolence Enterprise	Q-6	Surgery: UV lamp
Emission Filter 510/80 nm	Chroma	ET510/80m	Microscope
Head bar	custom made	see supplemental files	recording chamber
Infrared light	Thorlabs	M810L3	Behavior recording
LED projector	AAXA	P2B LED Pico Projector	present visual stimulus
Moist paper tissue (Kimwipe)	Kimtech Science	34155	Surgery: moist paper tissue
Motorized XY sample stage	Zaber	X-LRM050	Microscope
Neutral Density Filters (50% Transmission)	Thorlabs	NE203B	present visual stimulus
Ø1/2" Post Holder	ThorLabs	PH1.5V	Surgery: hollow tube for cannon
Ø1/2" Stainless Steel Optical Post	ThorLabs	TR150/M	Surgery: fish loading module
Objective lens 16x, 0.8NA	Nikon	CF175	Microscope
Oil-based modeling clay	Ly Hsin Clay	C4086	Surgery: head bar holder
Optical adhesive	Norland Products	NOA68	Surgery: UV curable glue
Photomultiplier tube	Hamamatsu	H11706P-40	Microscope
Piezo actuator	Physik Instrumente	P-725.4CA PIFOC	Microscope
Pockels Cell	Conoptics	M350-80-LA-BK-02	Microscope
Red Wratten filter (> 600 nm)	Edmund optics	#53-699	present visual stimulus
Resonant-Galvo Scan System	INSS	RGE-02	Microscope
Right-Angle Clamp for Ø1/2" Post	ThorLabs	RA90/M	Surgery: fish loading module
Rotating Clamp for Ø1/2" Post	ThorLabs	SWC/M	Surgery: fish loading module
ScanImage	MBF Bioscience	Basic version	Microscope
Semi-hexagonal tank	custom made	see supplemental files	recording chamber
Super-Bond C&B Kit	Sun Medical Co.	Super-Bond C&B	Surgery: dental cement
Tricaine methanesulfonate	Sigma Aldrich	E10521	Surgery: anesthetic
USB Camera	FLIR	BFS-U3-13Y3M-C	Behavior recording
Vetbond	3M	1469SB	Surgery: tissue glue