A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
הפרוטוקול מציג כלי חדש לפישוט הדמיה תוך חיונית באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך.
הבנת התנהגויות נורמליות וחריגות של תאי in vivo נחוצה לפיתוח התערבויות קליניות לסיכול התחלת המחלה והתקדמותה. לכן חיוני לייעל גישות הדמיה המאפשרות תצפית על דינמיקה של תאים באתרם, כאשר מבנה הרקמה והרכבה נותרים ללא הפרעה. האפידרמיס הוא המחסום החיצוני ביותר של הגוף, כמו גם המקור לסרטן האנושי הנפוץ ביותר, כלומר קרצינומה עורית של העור. הנגישות של רקמת העור מהווה הזדמנות ייחודית לנטר התנהגויות אפיתל ותאי עור בבעלי חיים שלמים באמצעות מיקרוסקופ תוך-חיוני לא פולשני. עם זאת, גישת הדמיה מתוחכמת זו הושגה בעיקר באמצעות מיקרוסקופים רבי-פוטונים זקופים, המהווים חסם כניסה משמעותי עבור רוב החוקרים. מחקר זה מציג עלון במה מותאם אישית למיקרוסקופ מודפס בתלת-ממד המתאים לשימוש עם מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך, ומייעל את ההדמיה התוך-חיונית ארוכת הטווח של עור האוזן בעכברים טרנסגניים חיים. אנו מאמינים כי המצאה רב-תכליתית זו, אשר עשויה להיות מותאמת אישית כך שתתאים למותג המיקרוסקופ ההפוך ולדגם המועדף ותותאם לתמונות של מערכות איברים נוספות, תוכיח את עצמה כבעלת ערך רב לקהילת המחקר המדעי הגדולה יותר על ידי שיפור משמעותי של הנגישות של מיקרוסקופיה תוך חיונית. התקדמות טכנולוגית זו היא קריטית לחיזוק הבנתנו את הדינמיקה של תאים חיים בהקשרים נורמליים ומחלות.
מיקרוסקופיה תוך-חיונית היא כלי רב עוצמה המאפשר ניטור של התנהגויות תאים בסביבות in-vivo שאינן מוטרדות. שיטה ייחודית זו סיפקה תובנות מפתח על פעולתן הפנימית של מערכות איברים מורכבות של יונקים, כולל ריאות1, מוח2, כבד3, בלוטת חלב4, מעי5 ועור6. יתר על כן, גישה זו חשפה שינויים התנהגותיים בתאים במהלך התפתחות הגידול7, ריפוי פצעים8,9, דלקת10, ופתולוגיות מגוונות אחרות באתרן. במחקר זה אנו מתמקדים בשיפור הנגישות של מ....
מחקר זה בוצע בהתאם להנחיות הטיפול והשימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת אמורי והמרכז הרפואי לענייני חיילים משוחררים באטלנטה ואושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC).
1. התקנת עלון ההדמיה החיה על במת המיקרוסקופ ההפוך
הרכבה נכונה של עלון הדמיה חיה במיקרוסקופ קונפוקלי הפוך והתמצאות מתאימה של עכבר מהונדס על גבי העלון מאומתת על ידי רכישת ערימות z של רקמת אוזן חיה עם תווית פלואורסצנטית לאורך מסלול זמן ≥1 שעות עם עדות מינימלית לסחף בצירי x, y ו-z. יש לצלם תמונות במרווחי זמן קבועים (זמן המרווח יהיה תלוי בשאלה הבי.......
במחקר זה אנו מציגים כלי חדש המאפשר הדמיה תוך-חיונית יציבה וארוכת טווח של אפיתל עור עכבר שלם על גבי מיקרוסקופים קונפוקליים הפוכים. המצאה זו עשויה PLA, שהוא החומר הנפוץ ביותר וזול ביותר להדפסה תלת מימדית; כל עלויות הדפסת התלת-ממד הפנימיות עבור עלון זה מסתכמות ב-<$5. את שני חלקי ההוספה הנפרדים (
אנו מודים לוולנטינה גרקו על עכברי K14-mCherry-H2B. אנו אסירי תודה לחנות המכונות של המחלקה לפיזיקה באוניברסיטת אמורי על יצירת דיסקיות כיסוי הזכוכית. עבודה זו מומנה על ידי פרס פיתוח קריירה #IK2 BX005370 מהמחלקה לענייני חיילים משוחררים של ארה"ב BLRD Service ל-LS, פרסי NIH RF1-AG079269 ו-R56-AG072473 ל-MJMR, ופרס I3 Emory SOM/GT Computational and Data Analysis Award ל-MJMR.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
3D Printer | Qudi Tech | i-Fast | 3D prints using PLA material |
40x 1.25NA silicone objective lens | Nikon | ||
AxR Laser Scanning Confocal Microscope | Nikon | ||
Cotton Tipped Swab | VWR | 76337-046 | Cream/ointment application |
Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891 | Induces GFP labeling of fibroblast nuclei in Pdgfra-rtTA; pTRE-H2B-GFP mice |
Flathead Screwdriver (2.5 mm) | Affiix insert to microscope stage | ||
Flathead Screws x 4 (#6-32) | Nikon | Screw insert into microscope stage | |
Glass Bottom Culture Dish | chemglass Life Sciences | CLS-1811-002 | Modified by removing walls of dish for use as coverslip disk compatible with live insert; 35 mm wide disk contains 20 mm wide glass coverslip; dish walls were removed by machine shop |
Heat Plate controller | Physitemp | TCAT-2LV | Animal Temperature Controller - Low Voltage; anal prob attachment for mouse body temperature monitoring |
Hex Wrench (1.5 mm) | For M3 setscrew adjustments | ||
Hex Wrench (2.5 mm) | Adjust tension on metal ear clip | ||
Intravital Imaging Insert | |||
Isoflurane | Med-Vet International | HPA030782-100uL | Mouse anesthesia |
Labeling Tape (or Scotch Tape) | VWR | 10127-458 | Alternative to metal ear clip to immobilize ear to coverslip |
Metal fastener | used as ear clip | ||
Mouse: C57BL/6-Pdgfraem1(rtTA)Xsun/J | The Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX:034459 | Fibrroblast-specific promoter driving doxycycline-inducible rtTA expression |
Mouse: K14-H2BPAmCherry | Courtesy of Dr. Valentina Greco at Yale University | Labels epidermal epithelial cell nuclei with mCherry; referred to in text as "K14-H2B-mCherry" | |
Mouse: pTRE-H2B-GFP: STOCK Tg(tetO-HIST1H2BJ/GFP)47Efu/J | The Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX:005104 | Labels fibroblast nuclei with GFP when combined with Pdgfra-rtTA and induced with doxycycline |
Multipurpose Sealing Wrap | Glad | Enhance mouse warmth | |
Optixcare | VWR | MSPP-078932779 | Eye lubricant |
Set screws x 3 (M3; 6 mm) | Thorlabs | SS3M6 | Attachment for heatplate module |
Silicone Immersion Oil | Applied to 40x silicone objective | ||
Small Animal Heating Plate | Physitemp | HP-4M | Provides heat to animal |
Somnoflow Low-Flow Electronic Vaporizer | Kent Scientific | SF-01 | Mouse anesthesia |
Vacuum Grease | Flinn Scientific | AP1095 | Seals coverslip disk to insert |
Veet | hair removal | ||
Water circulating heat pad | Stryker Medical | TP700 | for mouse revival post-imaging |
Explore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved