Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

הפרוטוקול מציג כלי חדש לפישוט הדמיה תוך חיונית באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך.

Abstract

הבנת התנהגויות נורמליות וחריגות של תאי in vivo נחוצה לפיתוח התערבויות קליניות לסיכול התחלת המחלה והתקדמותה. לכן חיוני לייעל גישות הדמיה המאפשרות תצפית על דינמיקה של תאים באתרם, כאשר מבנה הרקמה והרכבה נותרים ללא הפרעה. האפידרמיס הוא המחסום החיצוני ביותר של הגוף, כמו גם המקור לסרטן האנושי הנפוץ ביותר, כלומר קרצינומה עורית של העור. הנגישות של רקמת העור מהווה הזדמנות ייחודית לנטר התנהגויות אפיתל ותאי עור בבעלי חיים שלמים באמצעות מיקרוסקופ תוך-חיוני לא פולשני. עם זאת, גישת הדמיה מתוחכמת זו הושגה בעיקר באמצעות מיקרוסקופים רבי-פוטונים זקופים, המהווים חסם כניסה משמעותי עבור רוב החוקרים. מחקר זה מציג עלון במה מותאם אישית למיקרוסקופ מודפס בתלת-ממד המתאים לשימוש עם מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך, ומייעל את ההדמיה התוך-חיונית ארוכת הטווח של עור האוזן בעכברים טרנסגניים חיים. אנו מאמינים כי המצאה רב-תכליתית זו, אשר עשויה להיות מותאמת אישית כך שתתאים למותג המיקרוסקופ ההפוך ולדגם המועדף ותותאם לתמונות של מערכות איברים נוספות, תוכיח את עצמה כבעלת ערך רב לקהילת המחקר המדעי הגדולה יותר על ידי שיפור משמעותי של הנגישות של מיקרוסקופיה תוך חיונית. התקדמות טכנולוגית זו היא קריטית לחיזוק הבנתנו את הדינמיקה של תאים חיים בהקשרים נורמליים ומחלות.

Introduction

מיקרוסקופיה תוך-חיונית היא כלי רב עוצמה המאפשר ניטור של התנהגויות תאים בסביבות in-vivo שאינן מוטרדות. שיטה ייחודית זו סיפקה תובנות מפתח על פעולתן הפנימית של מערכות איברים מורכבות של יונקים, כולל ריאות1, מוח2, כבד3, בלוטת חלב4, מעי5 ועור6. יתר על כן, גישה זו חשפה שינויים התנהגותיים בתאים במהלך התפתחות הגידול7, ריפוי פצעים8,9, דלקת10, ופתולוגיות מגוונות אחרות באתרן. במחקר זה אנו מתמקדים בשיפור הנגישות של מ....

Protocol

מחקר זה בוצע בהתאם להנחיות הטיפול והשימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת אמורי והמרכז הרפואי לענייני חיילים משוחררים באטלנטה ואושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC).

1. התקנת עלון ההדמיה החיה על במת המיקרוסקופ ההפוך

  1. בנה את ההוספה באמצעות קובצי .stl .......

Representative Results

הרכבה נכונה של עלון הדמיה חיה במיקרוסקופ קונפוקלי הפוך והתמצאות מתאימה של עכבר מהונדס על גבי העלון מאומתת על ידי רכישת ערימות z של רקמת אוזן חיה עם תווית פלואורסצנטית לאורך מסלול זמן ≥1 שעות עם עדות מינימלית לסחף בצירי x, y ו-z. יש לצלם תמונות במרווחי זמן קבועים (זמן המרווח יהיה תלוי בשאלה הבי.......

Discussion

במחקר זה אנו מציגים כלי חדש המאפשר הדמיה תוך-חיונית יציבה וארוכת טווח של אפיתל עור עכבר שלם על גבי מיקרוסקופים קונפוקליים הפוכים. המצאה זו עשויה PLA, שהוא החומר הנפוץ ביותר וזול ביותר להדפסה תלת מימדית; כל עלויות הדפסת התלת-ממד הפנימיות עבור עלון זה מסתכמות ב-<$5. את שני חלקי ההוספה הנפרדים (

Acknowledgements

אנו מודים לוולנטינה גרקו על עכברי K14-mCherry-H2B. אנו אסירי תודה לחנות המכונות של המחלקה לפיזיקה באוניברסיטת אמורי על יצירת דיסקיות כיסוי הזכוכית. עבודה זו מומנה על ידי פרס פיתוח קריירה #IK2 BX005370 מהמחלקה לענייני חיילים משוחררים של ארה"ב BLRD Service ל-LS, פרסי NIH RF1-AG079269 ו-R56-AG072473 ל-MJMR, ופרס I3 Emory SOM/GT Computational and Data Analysis Award ל-MJMR.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
3D PrinterQudi Techi-Fast3D prints using PLA material
40x 1.25NA silicone objective lensNikon
AxR Laser Scanning Confocal MicroscopeNikon
Cotton Tipped SwabVWR76337-046Cream/ointment application
Doxycycline hyclateSigma-AldrichD9891Induces GFP labeling of fibroblast nuclei in Pdgfra-rtTA; pTRE-H2B-GFP mice
Flathead Screwdriver (2.5 mm)Affiix insert to microscope stage
Flathead Screws x 4 (#6-32)NikonScrew insert into microscope stage
Glass Bottom Culture Dishchemglass Life SciencesCLS-1811-002Modified by removing walls of dish for use as coverslip disk compatible with live insert; 35 mm wide disk contains 20 mm wide glass coverslip; dish walls were removed by machine shop
Heat Plate controllerPhysitempTCAT-2LVAnimal Temperature Controller - Low Voltage; anal prob attachment for mouse body temperature monitoring
Hex Wrench (1.5 mm)For M3 setscrew adjustments
Hex Wrench (2.5 mm)Adjust tension on metal ear clip
Intravital Imaging Insert
IsofluraneMed-Vet InternationalHPA030782-100uLMouse anesthesia
Labeling Tape (or Scotch Tape)VWR10127-458Alternative to metal ear clip to immobilize ear to coverslip
Metal fastenerused as ear clip
Mouse: C57BL/6-Pdgfraem1(rtTA)Xsun/JThe Jackson LaboratoryRRID: IMSR_JAX:034459Fibrroblast-specific promoter driving doxycycline-inducible rtTA expression
Mouse: K14-H2BPAmCherryCourtesy of Dr. Valentina Greco at Yale UniversityLabels epidermal epithelial cell nuclei with mCherry; referred to in text as "K14-H2B-mCherry"
Mouse: pTRE-H2B-GFP: STOCK
Tg(tetO-HIST1H2BJ/GFP)47Efu/J
The Jackson LaboratoryRRID: IMSR_JAX:005104 Labels fibroblast nuclei with GFP when combined with Pdgfra-rtTA and induced with doxycycline
Multipurpose Sealing WrapGladEnhance mouse warmth
OptixcareVWRMSPP-078932779Eye lubricant
Set screws x 3 (M3; 6 mm)ThorlabsSS3M6Attachment for heatplate module
Silicone Immersion OilApplied to 40x silicone objective
Small Animal Heating PlatePhysitempHP-4MProvides heat to animal
Somnoflow Low-Flow Electronic VaporizerKent ScientificSF-01Mouse anesthesia
Vacuum GreaseFlinn ScientificAP1095Seals coverslip disk to insert
Veethair removal 
Water circulating heat padStryker MedicalTP700for mouse revival post-imaging

References

  1. Babes, L., Yipp, B. G., Senger, D. L. Intravital microscopy of the metastatic pulmonary environment. Methods in Molecular Biology. , 383-396 (2023).
  2. Nal Chen, ., et al. Neutrophils promote glioblastoma tumor cell migration after bi....

Explore More Articles

Vivo

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved