A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Протокол представляет собой новый инструмент для упрощения прижизненной визуализации с помощью инвертированной конфокальной микроскопии.
Понимание нормального и аберрантного поведения клеток in vivo необходимо для разработки клинических вмешательств, направленных на предотвращение начала и прогрессирования заболевания. Поэтому крайне важно оптимизировать подходы к визуализации, которые облегчают наблюдение за клеточной динамикой in situ, когда структура и состав тканей остаются неизменными. Эпидермис является самым внешним барьером организма, а также источником наиболее распространенных видов рака человека, а именно кожных карцином. Доступность кожных тканей предоставляет уникальную возможность мониторинга поведения эпителиальных и дермальных клеток у интактных животных с помощью неинвазивной прижизненной микроскопии. Тем не менее, этот сложный подход к визуализации в основном был достигнут с помощью вертикальных многофотонных микроскопов, которые представляют собой значительный барьер для входа для большинства исследователей. В этом исследовании представлена специально разработанная, напечатанная на 3D-принтере вставка для микроскопа, подходящая для использования с инвертированными конфокальными микроскопами, оптимизирующая долгосрочную прижизненную визуализацию кожи уха у живых трансгенных мышей. Мы считаем, что это универсальное изобретение, которое может быть адаптировано к выбранной марке и модели инвертированного микроскопа и адаптировано для визуализации дополнительных систем органов, окажется бесценным для более широкого научно-исследовательского сообщества, значительно повысив доступность прижизненной микроскопии. Этот технологический прогресс имеет решающее значение для укрепления нашего понимания динамики живых клеток в нормальном и болезненном контекстах.
Прижизненная микроскопия является мощным инструментом, который позволяет отслеживать поведение клеток в их невозмущенной среде in vivo. Этот уникальный метод позволил получить ключевое представление о внутренней работе сложных систем органов млекопитающих, включая легкое1, мозг2, печень3, молочную железу4, кишечник5 и кожу6. Кроме того, этот подход выявил поведенческие изменения клеток во время развития опухоли7, заживления ран8,9, воспаления....
Это исследование было проведено в соответствии с рекомендациями по уходу за животными и использованию Медицинского центра по делам ветеранов Университета Эмори и Атланты и было одобрено Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC).
1. Ус?.......
Правильная сборка вставки с изображением в реальном времени на инвертированном конфокальном микроскопе и правильная ориентация трансгенной мыши на вставке подтверждается путем получения z-стеков флуоресцентно меченной живой ушной ткани в течение ≥1 ч с минимальными признаками дрей?.......
В этом исследовании мы представляем новый инструмент, который обеспечивает стабильную, долгосрочную прижизненную визуализацию интактного эпителия кожи мышей на инвертированных конфокальных микроскопах. Это изобретение изготовлено из PLA, который является наиболее распространенным ?.......
У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.
Благодарим Валентину Греко за мышей K14-mCherry-H2B. Мы благодарны механическому цеху физического факультета Университета Эмори за создание стеклянных покровных дисков. Эта работа была профинансирована премией Career Development Award #IK2 BX005370 от Министерства по делам ветеранов США BLRD Service to LS, NIH Awards RF1-AG079269 и R56-AG072473 для MJMR и I3 Emory SOM/GT Computational and Data Analysis Award для MJMR.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
3D Printer | Qudi Tech | i-Fast | 3D prints using PLA material |
40x 1.25NA silicone objective lens | Nikon | ||
AxR Laser Scanning Confocal Microscope | Nikon | ||
Cotton Tipped Swab | VWR | 76337-046 | Cream/ointment application |
Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891 | Induces GFP labeling of fibroblast nuclei in Pdgfra-rtTA; pTRE-H2B-GFP mice |
Flathead Screwdriver (2.5 mm) | Affiix insert to microscope stage | ||
Flathead Screws x 4 (#6-32) | Nikon | Screw insert into microscope stage | |
Glass Bottom Culture Dish | chemglass Life Sciences | CLS-1811-002 | Modified by removing walls of dish for use as coverslip disk compatible with live insert; 35 mm wide disk contains 20 mm wide glass coverslip; dish walls were removed by machine shop |
Heat Plate controller | Physitemp | TCAT-2LV | Animal Temperature Controller - Low Voltage; anal prob attachment for mouse body temperature monitoring |
Hex Wrench (1.5 mm) | For M3 setscrew adjustments | ||
Hex Wrench (2.5 mm) | Adjust tension on metal ear clip | ||
Intravital Imaging Insert | |||
Isoflurane | Med-Vet International | HPA030782-100uL | Mouse anesthesia |
Labeling Tape (or Scotch Tape) | VWR | 10127-458 | Alternative to metal ear clip to immobilize ear to coverslip |
Metal fastener | used as ear clip | ||
Mouse: C57BL/6-Pdgfraem1(rtTA)Xsun/J | The Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX:034459 | Fibrroblast-specific promoter driving doxycycline-inducible rtTA expression |
Mouse: K14-H2BPAmCherry | Courtesy of Dr. Valentina Greco at Yale University | Labels epidermal epithelial cell nuclei with mCherry; referred to in text as "K14-H2B-mCherry" | |
Mouse: pTRE-H2B-GFP: STOCK Tg(tetO-HIST1H2BJ/GFP)47Efu/J | The Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX:005104 | Labels fibroblast nuclei with GFP when combined with Pdgfra-rtTA and induced with doxycycline |
Multipurpose Sealing Wrap | Glad | Enhance mouse warmth | |
Optixcare | VWR | MSPP-078932779 | Eye lubricant |
Set screws x 3 (M3; 6 mm) | Thorlabs | SS3M6 | Attachment for heatplate module |
Silicone Immersion Oil | Applied to 40x silicone objective | ||
Small Animal Heating Plate | Physitemp | HP-4M | Provides heat to animal |
Somnoflow Low-Flow Electronic Vaporizer | Kent Scientific | SF-01 | Mouse anesthesia |
Vacuum Grease | Flinn Scientific | AP1095 | Seals coverslip disk to insert |
Veet | hair removal | ||
Water circulating heat pad | Stryker Medical | TP700 | for mouse revival post-imaging |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved