Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Протокол представляет собой новый инструмент для упрощения прижизненной визуализации с помощью инвертированной конфокальной микроскопии.

Abstract

Понимание нормального и аберрантного поведения клеток in vivo необходимо для разработки клинических вмешательств, направленных на предотвращение начала и прогрессирования заболевания. Поэтому крайне важно оптимизировать подходы к визуализации, которые облегчают наблюдение за клеточной динамикой in situ, когда структура и состав тканей остаются неизменными. Эпидермис является самым внешним барьером организма, а также источником наиболее распространенных видов рака человека, а именно кожных карцином. Доступность кожных тканей предоставляет уникальную возможность мониторинга поведения эпителиальных и дермальных клеток у интактных животных с помощью неинвазивной прижизненной микроскопии. Тем не менее, этот сложный подход к визуализации в основном был достигнут с помощью вертикальных многофотонных микроскопов, которые представляют собой значительный барьер для входа для большинства исследователей. В этом исследовании представлена специально разработанная, напечатанная на 3D-принтере вставка для микроскопа, подходящая для использования с инвертированными конфокальными микроскопами, оптимизирующая долгосрочную прижизненную визуализацию кожи уха у живых трансгенных мышей. Мы считаем, что это универсальное изобретение, которое может быть адаптировано к выбранной марке и модели инвертированного микроскопа и адаптировано для визуализации дополнительных систем органов, окажется бесценным для более широкого научно-исследовательского сообщества, значительно повысив доступность прижизненной микроскопии. Этот технологический прогресс имеет решающее значение для укрепления нашего понимания динамики живых клеток в нормальном и болезненном контекстах.

Introduction

Прижизненная микроскопия является мощным инструментом, который позволяет отслеживать поведение клеток в их невозмущенной среде in vivo. Этот уникальный метод позволил получить ключевое представление о внутренней работе сложных систем органов млекопитающих, включая легкое1, мозг2, печень3, молочную железу4, кишечник5 и кожу6. Кроме того, этот подход выявил поведенческие изменения клеток во время развития опухоли7, заживления ран8,9, воспаления....

Protocol

Это исследование было проведено в соответствии с рекомендациями по уходу за животными и использованию Медицинского центра по делам ветеранов Университета Эмори и Атланты и было одобрено Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC).

1. Ус?.......

Representative Results

Правильная сборка вставки с изображением в реальном времени на инвертированном конфокальном микроскопе и правильная ориентация трансгенной мыши на вставке подтверждается путем получения z-стеков флуоресцентно меченной живой ушной ткани в течение ≥1 ч с минимальными признаками дрей?.......

Discussion

В этом исследовании мы представляем новый инструмент, который обеспечивает стабильную, долгосрочную прижизненную визуализацию интактного эпителия кожи мышей на инвертированных конфокальных микроскопах. Это изобретение изготовлено из PLA, который является наиболее распространенным ?.......

Acknowledgements

Благодарим Валентину Греко за мышей K14-mCherry-H2B. Мы благодарны механическому цеху физического факультета Университета Эмори за создание стеклянных покровных дисков. Эта работа была профинансирована премией Career Development Award #IK2 BX005370 от Министерства по делам ветеранов США BLRD Service to LS, NIH Awards RF1-AG079269 и R56-AG072473 для MJMR и I3 Emory SOM/GT Computational and Data Analysis Award для MJMR.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
3D PrinterQudi Techi-Fast3D prints using PLA material
40x 1.25NA silicone objective lensNikon
AxR Laser Scanning Confocal MicroscopeNikon
Cotton Tipped SwabVWR76337-046Cream/ointment application
Doxycycline hyclateSigma-AldrichD9891Induces GFP labeling of fibroblast nuclei in Pdgfra-rtTA; pTRE-H2B-GFP mice
Flathead Screwdriver (2.5 mm)Affiix insert to microscope stage
Flathead Screws x 4 (#6-32)NikonScrew insert into microscope stage
Glass Bottom Culture Dishchemglass Life SciencesCLS-1811-002Modified by removing walls of dish for use as coverslip disk compatible with live insert; 35 mm wide disk contains 20 mm wide glass coverslip; dish walls were removed by machine shop
Heat Plate controllerPhysitempTCAT-2LVAnimal Temperature Controller - Low Voltage; anal prob attachment for mouse body temperature monitoring
Hex Wrench (1.5 mm)For M3 setscrew adjustments
Hex Wrench (2.5 mm)Adjust tension on metal ear clip
Intravital Imaging Insert
IsofluraneMed-Vet InternationalHPA030782-100uLMouse anesthesia
Labeling Tape (or Scotch Tape)VWR10127-458Alternative to metal ear clip to immobilize ear to coverslip
Metal fastenerused as ear clip
Mouse: C57BL/6-Pdgfraem1(rtTA)Xsun/JThe Jackson LaboratoryRRID: IMSR_JAX:034459Fibrroblast-specific promoter driving doxycycline-inducible rtTA expression
Mouse: K14-H2BPAmCherryCourtesy of Dr. Valentina Greco at Yale UniversityLabels epidermal epithelial cell nuclei with mCherry; referred to in text as "K14-H2B-mCherry"
Mouse: pTRE-H2B-GFP: STOCK
Tg(tetO-HIST1H2BJ/GFP)47Efu/J
The Jackson LaboratoryRRID: IMSR_JAX:005104 Labels fibroblast nuclei with GFP when combined with Pdgfra-rtTA and induced with doxycycline
Multipurpose Sealing WrapGladEnhance mouse warmth
OptixcareVWRMSPP-078932779Eye lubricant
Set screws x 3 (M3; 6 mm)ThorlabsSS3M6Attachment for heatplate module
Silicone Immersion OilApplied to 40x silicone objective
Small Animal Heating PlatePhysitempHP-4MProvides heat to animal
Somnoflow Low-Flow Electronic VaporizerKent ScientificSF-01Mouse anesthesia
Vacuum GreaseFlinn ScientificAP1095Seals coverslip disk to insert
Veethair removal 
Water circulating heat padStryker MedicalTP700for mouse revival post-imaging

References

  1. Babes, L., Yipp, B. G., Senger, D. L. Intravital microscopy of the metastatic pulmonary environment. Methods in Molecular Biology. , 383-396 (2023).
  2. Nal Chen, ., et al. Neutrophils promote glioblastoma tumor cell migration after bi....

Explore More Articles

in vivo

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved