يتم دعم هذا البحث من قبل R35GM148160 (C. C.) ومنحة تدريب المعاهد الوطنية للصحة (NIH) T32 GM007270 (R. C. S)

ملاحظة: يوضح الشكل 1 المواد المطلوبة لإجراء هذه الدراسة.
1. الاعتبارات والاستعدادات للتجربة
<ol><li>منع اليرقات من الاكتظاظ. ملاحظة: ترتبط جودة أدمغة اليرقات المزروعة ارتباطا مباشرا بصحة وجودة اليرقات قبل التشريح. اليرقات التي تعاني من سوء التغذية م...

تصوير نبتات الدماغ الحية من ذبابة الفاكهة الميلانوجاستر يرقات Instar الثالثة

<ol>
	<li>Delgado, M. K., Cabernard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+regulation+of+cell+size,+fate,+and+behavior+during+asymmetric+cell+division.">Mechanical regulation of cell size, fate, and behavior during asymmetric cell division.</a> Current Opinion in Cell Biology. 67, 9-16 (2020).</li><li>Sunchu, B., Cabernard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+mechanisms+of+asymmetric+cell+division.">Principles and mechanisms of asymmetric cell division.</a> Development. 147 (13), (2020).</li><li>Homem, C. C. F., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+neuroblasts:+A+model+for+stem+cell+biology.">Drosophila neuroblasts: A model for stem cell biology.</a> Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).</li><li>Gallaud, E., Pham, T., Cabernard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster+neuroblasts:+A+model+for+asymmetric+stem+cell+divisions.">Drosophila melanogaster neuroblasts: A model for asymmetric stem cell divisions.</a> Results and Problems in Cell Differentiation. 61 (1489), 183-210 (2017).</li><li>Loyer, N., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Where+does+asymmetry+come+from?+Illustrating+principles+of+polarity+and+asymmetry+establishment+in+Drosophila+neuroblasts.">Where does asymmetry come from? Illustrating principles of polarity and asymmetry establishment in Drosophila neuroblasts.</a> Current Opinion in Cell Biology. 62, 70-77 (2020).</li><li>Pollington, H. Q., Seroka, A. Q., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+temporal+patterning+to+neuronal+connectivity+in+Drosophila+type+I+neuroblast+lineages.">From temporal patterning to neuronal connectivity in Drosophila type I neuroblast lineages.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 142, 4-12 (2023).</li><li>Oon, C. H., Prehoda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+recruitment+and+actin+dependent+cortical+flows+drive+the+neuroblast+polarity+cycle.">Asymmetric recruitment and actin dependent cortical flows drive the neuroblast polarity cycle.</a> eLife. 8, e45815 (2019).</li><li>Ramat, A., Hannaford, M., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+miranda+localization+in+Drosophila+neuroblasts+involves+interaction+with+the+cognate+mRNA.">Maintenance of miranda localization in Drosophila neuroblasts involves interaction with the cognate mRNA.</a> Current Biology. 27 (14), 2101-2111 (2017).</li><li>Oon, C. H., Prehoda, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phases+of+cortical+actomyosin+dynamics+coupled+to+the+neuroblast+polarity+cycle.">Phases of cortical actomyosin dynamics coupled to the neuroblast polarity cycle.</a> eLife. 10, e66574 (2021).</li><li>LaFoya, B., Prehoda, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin-dependent+membrane+polarization+reveals+the+mechanical+nature+of+the+neuroblast+polarity+cycle.">Actin-dependent membrane polarization reveals the mechanical nature of the neuroblast polarity cycle.</a> Cell Reports. 35 (7), 109146 (2021).</li><li>Siller, K. H., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lis1/dynactin+regulates+metaphase+spindle+orientation+in+Drosophila+neuroblasts.">Lis1/dynactin regulates metaphase spindle orientation in Drosophila neuroblasts.</a> Developmental Biology. 319 (1), 1-9 (2008).</li><li>Siller, K. H., Cabernard, C., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NuMA-related+Mud+protein+binds+Pins+and+regulates+spindle+orientation+in+Drosophila+neuroblasts.">The NuMA-related Mud protein binds Pins and regulates spindle orientation in Drosophila neuroblasts.</a> Nature Cell Biology. 8 (6), 594-600 (2006).</li><li>Cabernard, C., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical/basal+spindle+orientation+is+required+for+neuroblast+homeostasis+and+neuronal+differentiation+in+Drosophila.">Apical/basal spindle orientation is required for neuroblast homeostasis and neuronal differentiation in Drosophila.</a> Developmental Cell. 17 (1), 134-141 (2009).</li><li>Cabernard, C., Prehoda, K. E., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+spindle-independent+cleavage+furrow+positioning+pathway.">A spindle-independent cleavage furrow positioning pathway.</a> Nature. 467 (7311), 91-94 (2010).</li><li>Connell, M., Cabernard, C., Ricketson, D., Doe, C. Q., Prehoda, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+cortical+extension+shifts+cleavage+furrow+position+in+Drosophila+neuroblasts.">Asymmetric cortical extension shifts cleavage furrow position in Drosophila neuroblasts.</a> Molecular Biology of the Cell. 22 (22), 4220-4226 (2011).</li><li>Tsankova, A., Pham, T. T., Garcia, D. S., Otte, F., Cabernard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+polarity+regulates+biased+myosin+activity+and+dynamics+during+asymmetric+cell+division+via+Drosophila+rho+kinase+and+protein+kinase+N.">Cell polarity regulates biased myosin activity and dynamics during asymmetric cell division via Drosophila rho kinase and protein kinase N.</a> Developmental Cell. 42 (2), 143-155 (2017).</li><li>Montembault, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+efflux+promotes+cell+elongation+to+coordinate+chromosome+segregation+with+cell+cleavage.">Myosin efflux promotes cell elongation to coordinate chromosome segregation with cell cleavage.</a> Nature Communications. 8 (1), 326 (2017).</li><li>Roubinet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporally+separated+cortical+flows+and+spindle+geometry+establish+physical+asymmetry+in+fly+neural+stem+cells.">Spatio-temporally separated cortical flows and spindle geometry establish physical asymmetry in fly neural stem cells.</a> Nature Communications. 8 (1), 1383 (2017).</li><li>Januschke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrobin+controls+mother-daughter+centriole+asymmetry+in+Drosophila+neuroblasts.">Centrobin controls mother-daughter centriole asymmetry in Drosophila neuroblasts.</a> Nature Cell Biology. 15 (3), 241-248 (2013).</li><li>Januschke, J., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+neuroblasts+retain+the+daughter+centrosome.">Drosophila neuroblasts retain the daughter centrosome.</a> Nature Communications. 2 (1), 243 (2011).</li><li>Rebollo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionally+unequal+centrosomes+drive+spindle+orientation+in+asymmetrically+dividing+Drosophila+neural+stem+cells.">Functionally unequal centrosomes drive spindle orientation in asymmetrically dividing Drosophila neural stem cells.</a> Developmental Cell. 12 (3), 467-474 (2007).</li><li>Januschke, J., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interphase+microtubule+aster+is+a+determinant+of+asymmetric+division+orientation+in+Drosophila+neuroblasts.">The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts.</a> The Journal of Cell Biology. 188 (5), 693-706 (2010).</li><li>Rusan, N. M., Peifer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+a+novel+centrosome+cycle+in+asymmetric+cell+division.">A role for a novel centrosome cycle in asymmetric cell division.</a> The Journal of Cell Biology. 177 (1), 13-20 (2007).</li><li>Lerit, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interphase+centrosome+organization+by+the+PLP-Cnn+scaffold+is+required+for+centrosome+function.">Interphase centrosome organization by the PLP-Cnn scaffold is required for centrosome function.</a> Journal of Cell Biology. 210 (1), 79-97 (2015).</li><li>Gallaud, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+centriolar+localization+of+Polo+and+Centrobin+in+early+mitosis+primes+centrosome+asymmetry.">Dynamic centriolar localization of Polo and Centrobin in early mitosis primes centrosome asymmetry.</a> PLoS Biology. 18 (8), e3000762 (2020).</li><li>Ramdas Nair, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microcephaly-associated+protein+Wdr62/CG7337+is+required+to+maintain+centrosome+asymmetry+in+Drosophila+neuroblasts.">The microcephaly-associated protein Wdr62/CG7337 is required to maintain centrosome asymmetry in Drosophila neuroblasts.</a> Cell Reports. 14 (5), 1100-1113 (2016).</li><li>Singh, P., Nair, A. R., Cabernard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+centriolar+protein+Bld10/Cep135+is+required+to+establish+centrosome+asymmetry+in+Drosophila+neuroblasts.">The centriolar protein Bld10/Cep135 is required to establish centrosome asymmetry in Drosophila neuroblasts.</a> Current Biology. 24 (13), 1548-1555 (2014).</li><li>LaFoya, B., Prehoda, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consumption+of+a+polarized+membrane+reservoir+drives+asymmetric+membrane+expansion+during+the+unequal+divisions+of+neural+stem+cells.">Consumption of a polarized membrane reservoir drives asymmetric membrane expansion during the unequal divisions of neural stem cells.</a> Developmental Cell. 1534 (23), 00159 (2023).</li><li>Sunchu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+chromatin+retention+and+nuclear+envelopes+separate+chromosomes+in+fused+cells+in+vivo.">Asymmetric chromatin retention and nuclear envelopes separate chromosomes in fused cells in vivo.</a> Communications Biology. 5 (1), 953 (2022).</li><li>Oliveira, A. C., Rebelo, A. R., Homem, C. C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+animal+development:+How+hormones+and+metabolism+regulate+developmental+transitions+and+brain+formation.">Integrating animal development: How hormones and metabolism regulate developmental transitions and brain formation.</a> Developmental Biology. 475, 256-264 (2021).</li><li>Britton, J. S., Edgar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+control+of+the+cell+cycle+in+Drosophila:+nutrition+activates+mitotic+and+endoreplicative+cells+by+distinct+mechanisms.">Environmental control of the cell cycle in Drosophila: nutrition activates mitotic and endoreplicative cells by distinct mechanisms.</a> Development. 125 (11), 2149-2158 (1998).</li><li>Lee, C. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Aurora-A+kinase+inhibits+neuroblast+self-renewal+by+regulating+aPKC/Numb+cortical+polarity+and+spindle+orientation.">Drosophila Aurora-A kinase inhibits neuroblast self-renewal by regulating aPKC/Numb cortical polarity and spindle orientation.</a> Genes &amp; Development. 20 (24), 3464-3474 (2006).</li><li>Homem, C. C. F., Reichardt, I., Berger, C., Lendl, T., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+live+cell+imaging+and+automated+4D+analysis+of+Drosophila+neuroblast+lineages.">Long-term live cell imaging and automated 4D analysis of Drosophila neuroblast lineages.</a> PLoS ONE. 8 (11), e79588 (2013).</li><li>Cabernard, C., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+neuroblast+lineages+within+intact+larval+brains+in+Drosophila.">Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), 970-977 (2013).</li><li>Karpova, N., Bobinnec, Y., Fouix, S., Huitorel, P., Debec, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jupiter,+a+new+Drosophila+protein+associated+with+microtubules.">Jupiter, a new Drosophila protein associated with microtubules.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 63 (5), 301-312 (2006).</li><li>Loyer, N., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+last-born+daughter+cell+contributes+to+division+orientation+of+Drosophila+larval+neuroblasts.">The last-born daughter cell contributes to division orientation of Drosophila larval neuroblasts.</a> Nature Communications. 9 (1), 3745 (2018).</li><li>Bostock, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immobilization+technique+for+long-term+time-lapse+imaging+of+explanted+Drosophila+tissues.">An immobilization technique for long-term time-lapse imaging of explanted Drosophila tissues.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 590094 (2020).</li></ol>

يحدد هذا البروتوكول نهجا واحدا لتصوير أدمغة النباتات الحية من يرقات ذبابة الفاكهة الميلانوجاستر . يسمح البروتوكول الموصوف هنا بمراقبة أدمغة الزرع لمدة 12-20 ساعة في ظل الظروف التجريبية المناسبة. يجب إيلاء اهتمام خاص لإعداد العينات وتصميم التجارب المطلوبة. كما ذكر أعلاه ، فإن أحد أهم ا?...

انقسام الخلايا غير المتماثل (ACD) هو العملية التي يتم من خلالها تقسيم المكونات تحت الخلوية مثل الحمض النووي الريبي والبروتينات والعضيات بشكل غير متساو بين الخلايا الوليدة 1,2. تظهر هذه العملية بشكل شائع في الخلايا الجذعية ، التي تخضع ل ACD لتؤدي إلى ظهور خلايا ابنة ذات مصائر تنموية مختلفة. ذبابة الفاكهة تنقسم NBs بشكل غير متماثل لإنتاج NB واحد ، والذي يحتفظ بجذعه ، وخلية أم واحدة (GMC). يخضع GMC لمزيد من الانقسامات لإنتاج الخلايا العصبية المتمايزة أو الدبقية3. NBs المقسمة بشكل غير متماثل وفيرة في الأدمغة النامية لليرقات الثالثة ، والتي يمكن ملاحظتها بسهولة عن طريق الفحص المجهري. في المرحلة الثالثة من اليرقات الداخلية ، يوجد ما يقرب من 100 NBs في كل فص دماغي مركزي3،4،5،6.
انقسام الخلايا غير المتماثل هو عملية ديناميكية للغاية. تم استخدام بروتوكولات تصوير الخلايا الحية لقياس وقياس ديناميكيات قطبية الخلية7،8،9،10 ، اتجاه المغزل 11،12،13 ، ديناميات قشرة الأكتوميوسين 14،15،16،17،18 ، الأنابيب الدقيقة وبيولوجيا الجسيم المركزي 19،20، 21،22،23،24،25،26،27 ، والغشاء10،28 وديناميات الكروماتين 29. تعتمد الأوصاف النوعية والكمية ل ACD على طرق وبروتوكولات قوية لتقسيم NBs في أدمغة حية سليمة. يحدد البروتوكول التالي طرق تحضير وتشريح وتصوير أدمغة اليرقات الثالثة لتصوير الخلايا الحية في الجسم الحي باستخدام طريقتين مختلفتين للتركيب. هذه الطرق هي الأنسب للباحثين المهتمين بالديناميكيات الزمانية المكانية لانقسامات الخلايا الجذعية ، وكذلك الانقسامات في خلايا الدماغ الأخرى ، لأنها تسمح بمراقبة الأحداث الخلوية على المدى القصير والطويل. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن الوصول بسهولة إلى هذه التقنيات للقادمين الجدد إلى هذا المجال. لقد أثبتنا فعالية هذا النهج وقدرته على التكيف مع أدمغة اليرقات التي تعبر عن الأنابيب الدقيقة الموسومة بالفلورسنت وبروتينات الاندماج القشري. بالإضافة إلى ذلك ، نناقش طرق التحليل واعتبارات التطبيق في دراسات أخرى.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m polyethersulfone (PES) Membrane</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>25-231</td>
			<td>Vacuum-driven filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>20-248</td>
			<td>granulated agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Computer</td>
			<td>Dell</td>
			<td>NA</td>
			<td>Intel Xeon Gold 5222 CPU with two 3.80 GHz processors running Windows 10 on a 64-bit operating system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Growth Serum</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30541.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chambered Imaging Slides</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom-machined metal slide</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>See Cabernard and Doe 2013 (Ref. 34) for specifications</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>5024343</td>
			<td>3-well porcelain micro spot plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>Dumont #5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>15003-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo collection cage</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>59-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flypad with access to CO2 to anesthetize adult flies</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>59-172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas-permeable membrane</td>
			<td>YSI</td>
			<td>98095</td>
			<td>Gas-permeable membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Cover Slides</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72204-03</td>
			<td># 1.5; 22 mm x 40 mm glass coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>NA</td>
			<td>Alternatives: Fiji, Volocity, Aivia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris File Converter</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant Yeast</td>
			<td>Saf-Instant</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molasses</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>62-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>628161</td>
			<td>60 mm x 15 mm Petri dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroleum Jelly</td>
			<td>Vaseline</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#39;s Insect Medium with L-glutamine and sodium bicarbonate liquid</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S0146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SlideBook acquisition software</td>
			<td>3i</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum-Driven Filtration Unit with a 0.22 &#181;&#181;m PES membrane filter</td>
			<td>Genesee Scientific, GenClone</td>
			<td>25-231</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live-cell imaging of drosophila melanogaster third instar larval brains

تخضع الخلايا الجذعية العصبية ذبابة الفاكهة (الخلايا العصبية ، NBs فيما بعد) لانقسامات غير متماثلة ، مما يؤدي إلى تجديد الخلايا العصبية ذاتية التجديد ، بينما تشكل أيضا خلية أم متمايزة (GMC) ، والتي ستخضع لتقسيم إضافي واحد ليؤدي إلى ظهور خليتين عصبيتين أو دبقية. كشفت الدراسات في NBs عن الآليات الجزيئية الكامنة وراء قطبية الخلية ، واتجاه المغزل ، والتجديد الذاتي للخلايا الجذعية العصبية ، والتمايز. يمكن ملاحظة هذه الانقسامات الخلوية غير المتماثلة بسهولة عن طريق تصوير الخلايا الحية ، مما يجعل اليرقات NBs مناسبة بشكل مثالي للتحقيق في الديناميات الزمانية المكانية لانقسام الخلايا غير المتماثل في الأنسجة الحية. عند تشريحها وتصويرها بشكل صحيح في وسط مكمل بالمغذيات ، تنقسم NBs في أدمغة الزرع بقوة لمدة 12-20 ساعة. الأساليب الموصوفة سابقا صعبة تقنيا وقد تشكل تحديا لأولئك الجدد في هذا المجال. هنا ، يتم وصف بروتوكول لإعداد وتشريح وتركيب وتصوير نباتات دماغ اليرقات الحية الثالثة باستخدام مكملات الجسم الدهنية. كما تتم مناقشة المشاكل المحتملة ، ويتم تقديم أمثلة لكيفية استخدام هذه التقنية.

Asymmetric cell division (ACD) is the process by which subcellular components such as RNA, proteins, and organelles are partitioned unequally between daughter cells1,2. This process is commonly seen in stem cells, which undergo ACD to give rise to daughter cells with different developmental fates. Drosophila NBs divide asymmetrically to produce one NB, which retains its stemness, and one ganglion mother cell (GMC). The GMC undergoes further divisions to produce differentiating neurons or glia3. Asymmetrically dividing NBs are abundant in the developing brains of third-instar larvae, which are readily observed via microscopy. At the third instar larval stage, there are roughly 100 NBs present in each central brain lobe3,4,5,6.
Asymmetric cell division is a highly dynamic process. Live-cell imaging protocols have been used to measure and quantify the dynamics of cell polarity7,8,9,10, spindle orientation11,12,13, the dynamics of the actomyosin cortex14,15,16,17,18, microtubule and centrosome biology19,20,21,22,23,24,25,26,27, and membrane10,28 and chromatin dynamics29. Qualitative and quantitative descriptions of ACD rely on robust methods and protocols to image dividing NBs in intact living brains. The following protocol outlines methods to prepare, dissect, and image third instar larval brains for live-cell imaging in vivo using two different mounting approaches. These methods are best suited for researchers interested in the spatiotemporal dynamics of stem cell divisions, as well as divisions in other brain cells, as they allow for short- and long-term observations of cellular events. Additionally, these techniques are readily accessible to newcomers to the field. We demonstrate the effectiveness and adaptability of this approach with larval brains expressing fluorescently tagged microtubule and cortical fusion proteins. We additionally discuss methods of analysis and considerations for application in other studies.

تسليط الضوء على المؤلف: التحقيق في ديناميكيات انقسام الخلايا غير المتماثلة: بروتوكول للتصوير الحي لنباتات دماغ يرقات ذبابة الفاكهة 

تصوير الخلايا الحية لذبابة الفاكهة الميلانوجاستر أدمغة اليرقات الثالثة

Our research focuses on studying the impact of asymmetric cell division or ACD, on stem cell proliferation and differentiation. We employ Drosophila neural stem cells or neuroblasts as a model to understand the mechanisms, regulations, and impacts of asymmetric cell division on development and neurogenesis. The recent developments in artificial intelligence have been making major strides in image quantification and analysis, which has significantly advanced the field of life cell imaging.Maintaining sample quality for a long-term movie is a long-standing challenge. While it's insightful to observe a sample for eight to 10 hours, logistical constraints, like the sample's imaging requirements and available imaging tools, make it difficult. Our protocol addresses this by demonstrating long-term imaging without impacting the sample's quality.Our technique could be easily adopted and applied to the field by newcomers. With some time and practice, one can feasibly generate short and long-term movies, which have the potential to yield insightful and meaningful data.

تشريح وتصوير الفص الدماغي المركزي NBs معبرا عن الدبابيس::EGFP والكرز::كوكب المشتري لعرض هذا البروتوكول ، اليرقات التي تعبر عن الكرز الذي يحركه UAS :: كوكب المشتري13 والمسمى داخليا الدبابيس :: EGFP16 (w ؛ worGal4 ، UAS-cherry :: jupiter / CyO ؛ تم تصوير الدبابيس :: EGFP / TM6B ، Tb) لمدة 4 س?...

Watch this Scientific Journal Video about Investigating Asymmetric Cell Division Dynamics: A Protocol for Live-Imaging of Drosophila Larval Brain Explants at JoVE.com

هنا ، نناقش سير العمل لإعداد وتشريح وتركيب وتصوير أدمغة الزرع الحية من يرقات ذبابة الفاكهة الميلانوجاستر الثالثة لمراقبة الديناميكيات الخلوية ودون الخلوية في ظل الظروف الفسيولوجية.

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a ...

يركز بحثنا على دراسة تأثير انقسام الخلايا غير المتماثل أو ACD على تكاثر الخلايا الجذعية وتمايزها. نحن نستخدم الخلايا الجذعية العصبية ذبابة الفاكهة أو الخلايا العصبية كنموذج لفهم آليات ولوائح وتأثيرات انقسام الخلايا غير المتماثل على التطور وتكوين الخلايا العصبية. حققت التطورات الأخيرة في الذكاء الاصطناعي خطوات كبيرة في تحديد كمية الصور وتحليلها ، مما أدى إلى تقدم كبير في مجال تصوير خلايا الحياة.يعد الحفاظ على جودة العينة لفيلم طويل الأجل تحديا طويل الأمد. في حين أنه من الثاقبة مراقبة عينة لمدة ثماني إلى 10 ساعات ، فإن القيود اللوجستية ، مثل متطلبات التصوير للعينة وأدوات التصوير المتاحة ، تجعل الأمر صعبا. يعالج بروتوكولنا هذا من خلال إظهار التصوير طويل المدى دون التأثير على جودة العينة.يمكن اعتماد تقنيتنا بسهولة وتطبيقها على هذا المجال من قبل القادمين الجدد. مع بعض الوقت والممارسة ، يمكن للمرء أن يولد أفلاما قصيرة وطويلة الأجل ، والتي لديها القدرة على إنتاج بيانات ثاقبة وذات مغزى.

live-cell-imaging-drosophila-melanogaster-third-instar-larval

تصوير الخلايا الحية لذبابة الفاكهة الميلانوجاستر أدمغة اليرقات الثالثة

Abstract