A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Aqui, discutimos um fluxo de trabalho para preparar, dissecar, montar e obter imagens de cérebros de explantes vivos de larvas de terceiro ínstar de Drosophila melanogaster para observar a dinâmica celular e subcelular sob condições fisiológicas.
As células-tronco neurais de Drosophila (neuroblastos, RNs doravante) sofrem divisões assimétricas, regenerando o neuroblasto auto-renovador, ao mesmo tempo em que formam uma célula-mãe do gânglio diferenciador (GMC), que sofrerá uma divisão adicional para dar origem a dois neurônios ou glia. Estudos em RNs descobriram os mecanismos moleculares subjacentes à polaridade celular, orientação fusiforme, auto-renovação e diferenciação de células-tronco neurais. Essas divisões celulares assimétricas são facilmente observáveis através de imagens de células vivas, tornando os RNs larvais ideais para investigar a dinâmica espaço-temporal da divisão celular assimétrica em tecidos vivos. Quando devidamente dissecados e imageados em meio suplementado com nutrientes, os RNs em cérebros explantes dividem-se robustamente por 12-20 h. Os métodos descritos anteriormente são tecnicamente difíceis e podem ser desafiadores para aqueles que estão começando na área. Aqui, um protocolo é descrito para a preparação, dissecção, montagem e imagem de explantes cerebrais de larvas de terceiro ínstar vivas usando suplementos de corpo gorduroso. Problemas potenciais também são discutidos, e exemplos são fornecidos de como essa técnica pode ser usada.
A divisão celular assimétrica (DCA) é o processo pelo qual componentes subcelulares como RNA, proteínas e organelas são particionados desigualmente entre as células filhas 1,2. Esse processo é comumente visto em células-tronco, que sofrem DCA para dar origem a células-filhas com diferentes destinos de desenvolvimento. Drosófila Os RNs dividem-se assimetricamente para produzir um RN, que retém sua caule, e uma célula-mãe ganglionar (GMC). O GMC sofre novas divisões para produzir neurônios diferenciadores ou glia3. RNs em divisão assimétrica são abundantes no cérebro em desenvolv....
OBS: A Figura 1 mostra os materiais necessários para a realização deste estudo.
1. Considerações e preparativos para a experiência
Dissecção e imagem de NBs do lobo cerebral central expressando Pins::EGFP e Cherry::Jupiter
Para mostrar este protocolo, larvas expressando Cherry::Jupiter13 e endogenamente marcadas Pins::EGFP16 (w; worGal4, UAS-cherry::jupiter/CyO; Pinos::EGFP/TM6B, Tb) foram fotografados por 4 h usando o protocolo descrito usando lâminas de imagem de múltiplos poços (Figura 5C,D). Dados adicionais foram obtidos de la.......
Este protocolo descreve uma abordagem para a obtenção de imagens de cérebros vivos de explantes de larvas de Drosophila melanogaster . O protocolo aqui descrito permite que cérebros de explantes sejam observados por 12-20 h sob as condições experimentais adequadas. Atenção especial deve ser dada à preparação das amostras e ao planejamento dos experimentos desejados. Como mencionado acima, um dos fatores mais críticos que determinam a qualidade do tecido dissecado é a saúde das larvas. Para alcança.......
Esta pesquisa é apoiada por R35GM148160 (C. C.) e um National Institutes of Health (NIH) Training Grant T32 GM007270 (R. C. S)
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.22 µm polyethersulfone (PES) Membrane | Genesee | 25-231 | Vacuum-driven filters |
Agar | Genesee | 20-248 | granulated agar |
Analytical Computer | Dell | NA | Intel Xeon Gold 5222 CPU with two 3.80 GHz processors running Windows 10 on a 64-bit operating system |
Bovine Growth Serum | HyClone | SH30541.02 | |
Chambered Imaging Slides | Ibidi | 80826 | |
Confocal Microscope | Nikon | NA | |
Custom-machined metal slide | NA | NA | See Cabernard and Doe 2013 (Ref. 34) for specifications |
Dissection Dishes | Fisher Scientific | 5024343 | 3-well porcelain micro spot plate |
Dissection Forceps | World Precision Instruments | Dumont #5 | |
Dissection Microscope | Leica | NA | |
Dissection Scissors | Fine Science Tools (FST) | 15003-08 | |
Embryo collection cage | Genesee | 59-100 | |
Flypad with access to CO2 to anesthetize adult flies | Genesee | 59-172 | |
Gas-permeable membrane | YSI | 98095 | Gas-permeable membrane |
Glass Cover Slides | Electron Microscopy Sciences | 72204-03 | # 1.5; 22 mm x 40 mm glass coverslips |
Imaris | Oxford Instruments | NA | Alternatives: Fiji, Volocity, Aivia |
Imaris File Converter | Oxford Instruments | NA | |
Instant Yeast | Saf-Instant | NA | |
Molasses | Genesee | 62-117 | |
Petri dish | Greiner Bio-One | 628161 | 60 mm x 15 mm Petri dish |
Petroleum Jelly | Vaseline | NA | |
Schneider's Insect Medium with L-glutamine and sodium bicarbonate liquid | Millipore Sigma | S0146 | |
SlideBook acquisition software | 3i | NA | |
Vacuum-Driven Filtration Unit with a 0.22 µµm PES membrane filter | Genesee Scientific, GenClone | 25-231 |
Explore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved