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  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Aqui, discutimos um fluxo de trabalho para preparar, dissecar, montar e obter imagens de cérebros de explantes vivos de larvas de terceiro ínstar de Drosophila melanogaster para observar a dinâmica celular e subcelular sob condições fisiológicas.

Abstract

As células-tronco neurais de Drosophila (neuroblastos, RNs doravante) sofrem divisões assimétricas, regenerando o neuroblasto auto-renovador, ao mesmo tempo em que formam uma célula-mãe do gânglio diferenciador (GMC), que sofrerá uma divisão adicional para dar origem a dois neurônios ou glia. Estudos em RNs descobriram os mecanismos moleculares subjacentes à polaridade celular, orientação fusiforme, auto-renovação e diferenciação de células-tronco neurais. Essas divisões celulares assimétricas são facilmente observáveis através de imagens de células vivas, tornando os RNs larvais ideais para investigar a dinâmica espaço-temporal da divisão celular assimétrica em tecidos vivos. Quando devidamente dissecados e imageados em meio suplementado com nutrientes, os RNs em cérebros explantes dividem-se robustamente por 12-20 h. Os métodos descritos anteriormente são tecnicamente difíceis e podem ser desafiadores para aqueles que estão começando na área. Aqui, um protocolo é descrito para a preparação, dissecção, montagem e imagem de explantes cerebrais de larvas de terceiro ínstar vivas usando suplementos de corpo gorduroso. Problemas potenciais também são discutidos, e exemplos são fornecidos de como essa técnica pode ser usada.

Introduction

A divisão celular assimétrica (DCA) é o processo pelo qual componentes subcelulares como RNA, proteínas e organelas são particionados desigualmente entre as células filhas 1,2. Esse processo é comumente visto em células-tronco, que sofrem DCA para dar origem a células-filhas com diferentes destinos de desenvolvimento. Drosófila Os RNs dividem-se assimetricamente para produzir um RN, que retém sua caule, e uma célula-mãe ganglionar (GMC). O GMC sofre novas divisões para produzir neurônios diferenciadores ou glia3. RNs em divisão assimétrica são abundantes no cérebro em desenvolv....

Protocol

OBS: A Figura 1 mostra os materiais necessários para a realização deste estudo.

1. Considerações e preparativos para a experiência

  1. Evitar que as larvas se superlotem.
    NOTA: A qualidade do cérebro das larvas de explantes está diretamente relacionada com a saúde e qualidade das larvas antes da dissecção. Larvas desnutridas por superlotação geralmente produzem cérebros de baixa qualidade30.
    1. Ce.......

Representative Results

Dissecção e imagem de NBs do lobo cerebral central expressando Pins::EGFP e Cherry::Jupiter
Para mostrar este protocolo, larvas expressando Cherry::Jupiter13 e endogenamente marcadas Pins::EGFP16 (w; worGal4, UAS-cherry::jupiter/CyO; Pinos::EGFP/TM6B, Tb) foram fotografados por 4 h usando o protocolo descrito usando lâminas de imagem de múltiplos poços (Figura 5C,D). Dados adicionais foram obtidos de la.......

Discussion

Este protocolo descreve uma abordagem para a obtenção de imagens de cérebros vivos de explantes de larvas de Drosophila melanogaster . O protocolo aqui descrito permite que cérebros de explantes sejam observados por 12-20 h sob as condições experimentais adequadas. Atenção especial deve ser dada à preparação das amostras e ao planejamento dos experimentos desejados. Como mencionado acima, um dos fatores mais críticos que determinam a qualidade do tecido dissecado é a saúde das larvas. Para alcança.......

Disclosures

Os autores não têm divulgações financeiras a declarar.

Acknowledgements

Esta pesquisa é apoiada por R35GM148160 (C. C.) e um National Institutes of Health (NIH) Training Grant T32 GM007270 (R. C. S)

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 µm polyethersulfone (PES) MembraneGenesee25-231Vacuum-driven filters
AgarGenesee20-248granulated agar
Analytical ComputerDellNAIntel Xeon Gold 5222 CPU with two 3.80 GHz processors running Windows 10 on a 64-bit operating system
Bovine Growth SerumHyCloneSH30541.02
Chambered Imaging SlidesIbidi80826
Confocal MicroscopeNikonNA
Custom-machined metal slideNANASee Cabernard and Doe 2013 (Ref. 34) for specifications
Dissection DishesFisher Scientific50243433-well porcelain micro spot plate
Dissection ForcepsWorld Precision InstrumentsDumont #5
Dissection MicroscopeLeicaNA
Dissection ScissorsFine Science Tools (FST)15003-08
Embryo collection cageGenesee59-100
Flypad with access to CO2 to anesthetize adult fliesGenesee59-172
Gas-permeable membraneYSI98095Gas-permeable membrane
Glass Cover SlidesElectron Microscopy Sciences72204-03# 1.5; 22 mm x 40 mm glass coverslips
ImarisOxford InstrumentsNAAlternatives: Fiji, Volocity, Aivia
Imaris File ConverterOxford InstrumentsNA
Instant YeastSaf-InstantNA
MolassesGenesee62-117
Petri dishGreiner Bio-One62816160 mm x 15 mm Petri dish
Petroleum JellyVaselineNA
Schneider's Insect Medium with L-glutamine and sodium bicarbonate liquidMillipore SigmaS0146
SlideBook acquisition software3iNA
Vacuum-Driven Filtration Unit with a 0.22 µµm PES membrane filterGenesee Scientific, GenClone25-231

References

  1. Delgado, M. K., Cabernard, C. Mechanical regulation of cell size, fate, and behavior during asymmetric cell division. Current Opinion in Cell Biology. 67, 9-16 (2020).
  2. Sunchu, B., Cabernard, C. Principles and mec....

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