Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Здесь мы обсуждаем рабочий процесс подготовки, препарирования, монтажа и изображения живого мозга эксплантата личинок третьего возраста Drosophila melanogaster для наблюдения за клеточной и субклеточной динамикой в физиологических условиях.

Abstract

Нервные стволовые клетки дрозофилы (нейробласты, далее NB) подвергаются асимметричному делению, регенерируя самообновляющийся нейробласт, а также образуя дифференцирующую ганглионарную материнскую клетку (GMC), которая претерпевает одно дополнительное деление, чтобы дать начало двум нейронам или глии. Исследования NB раскрыли молекулярные механизмы, лежащие в основе полярности клеток, ориентации веретена, самообновления и дифференцировки нервных стволовых клеток. Эти асимметричные клеточные деления легко наблюдаются с помощью визуализации живых клеток, что делает личинки NB идеально подходящими для исследования пространственно-временной динамики асимметричного деления клеток в живой ткани. При правильном препарировании и визуализации в среде, обогащенной питательными веществами, NB в мозге эксплантата надежно делятся в течение 12-20 часов. Ранее описанные методы технически сложны и могут быть сложными для новичков в этой области. Здесь описан протокол подготовки, вскрытия, монтажа и визуализации живых эксплантатов личинок третьего возраста с использованием добавок жирового тела. Также обсуждаются потенциальные проблемы и приводятся примеры того, как можно использовать эту технику.

Introduction

Асимметричное деление клеток (ACD) - это процесс, при котором субклеточные компоненты, такие как РНК, белки и органеллы, неравномерно распределяются между дочерними клетками 1,2. Этот процесс обычно наблюдается в стволовых клетках, которые подвергаются ACD, чтобы дать начало дочерним клеткам с различными судьбами развития. Дрозофила NB делятся асимметрично, образуя один NB, который сохраняет свою стволовость, и одну ганглионарную материнскую клетку (GMC). GMC подвергается дальнейшим делениям с образованием дифференцирующих нейронов или глии3. Асимметрично делящиеся NB в изобили....

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1 показаны материалы, необходимые для проведения этого исследования.

1. Соображения и подготовка к эксперименту

  1. Не допускайте переполнения личинок.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Качество мозга эксплантата личинок напрямую связано со.......

Representative Results

Вскрытие и визуализация НБ центральной доли мозга, экспрессирующих Pins::EGFP и Cherry::Jupiter
Чтобы продемонстрировать этот протокол, личинки экспрессируют управляемый UAS Cherry::Jupiter13 и эндогенно помеченные Pins::EGFP16 (w; worGal4, UAS-cherry::jupiter/CyO; Pins::EGFP/TM6B, Tb) визуализирова.......

Discussion

В этом протоколе изложен один из подходов к визуализации живого мозга эксплантатов личинок Drosophila melanogaster . Описанный здесь протокол позволяет наблюдать за мозгом эксплантата в течение 12-20 часов в правильных экспериментальных условиях. Особое внимание должно быть уделено подготов?.......

Disclosures

У авторов нет финансовой информации, которую они могли бы декларировать.

Acknowledgements

Это исследование поддерживается R35GM148160 (C.C.) и Национальным институтом здравоохранения (NIH) Training Grant T32 GM007270 (R.C.S.)

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 µm polyethersulfone (PES) MembraneGenesee25-231Vacuum-driven filters
AgarGenesee20-248granulated agar
Analytical ComputerDellNAIntel Xeon Gold 5222 CPU with two 3.80 GHz processors running Windows 10 on a 64-bit operating system
Bovine Growth SerumHyCloneSH30541.02
Chambered Imaging SlidesIbidi80826
Confocal MicroscopeNikonNA
Custom-machined metal slideNANASee Cabernard and Doe 2013 (Ref. 34) for specifications
Dissection DishesFisher Scientific50243433-well porcelain micro spot plate
Dissection ForcepsWorld Precision InstrumentsDumont #5
Dissection MicroscopeLeicaNA
Dissection ScissorsFine Science Tools (FST)15003-08
Embryo collection cageGenesee59-100
Flypad with access to CO2 to anesthetize adult fliesGenesee59-172
Gas-permeable membraneYSI98095Gas-permeable membrane
Glass Cover SlidesElectron Microscopy Sciences72204-03# 1.5; 22 mm x 40 mm glass coverslips
ImarisOxford InstrumentsNAAlternatives: Fiji, Volocity, Aivia
Imaris File ConverterOxford InstrumentsNA
Instant YeastSaf-InstantNA
MolassesGenesee62-117
Petri dishGreiner Bio-One62816160 mm x 15 mm Petri dish
Petroleum JellyVaselineNA
Schneider's Insect Medium with L-glutamine and sodium bicarbonate liquidMillipore SigmaS0146
SlideBook acquisition software3iNA
Vacuum-Driven Filtration Unit with a 0.22 µµm PES membrane filterGenesee Scientific, GenClone25-231

References

  1. Delgado, M. K., Cabernard, C. Mechanical regulation of cell size, fate, and behavior during asymmetric cell division. Current Opinion in Cell Biology. 67, 9-16 (2020).
  2. Sunchu, B., Cabernard, C. Principles and mec....

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

196

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved