Imaging delle cellule vive di Drosophila melanogaster Terzo stadio Larvale Cervelli

Riepilogo

Qui, discutiamo di un flusso di lavoro per preparare, sezionare, montare e visualizzare cervelli di espianti vivi da larve di terzo stadio di Drosophila melanogaster per osservare le dinamiche cellulari e subcellulari in condizioni fisiologiche.

Abstract

Le cellule staminali neurali della Drosophila (neuroblasti, NB in seguito) subiscono divisioni asimmetriche, rigenerando il neuroblasto auto-rinnovante, formando anche una cellula madre gangliare differenziante (GMC), che subirà una divisione aggiuntiva per dare origine a due neuroni o glia. Studi in NB hanno scoperto i meccanismi molecolari alla base della polarità cellulare, dell'orientamento del fuso, dell'auto-rinnovamento delle cellule staminali neurali e della differenziazione. Queste divisioni cellulari asimmetriche sono facilmente osservabili tramite imaging di cellule vive, rendendo le NB larvali ideali per studiare le dinamiche spaziotemporali della divisione cellulare asimmetrica nei tessuti viventi. Se adeguatamente sezionati e ripresi in un mezzo integrato con sostanze nutritive, gli NB nei cervelli espiantati si dividono robustamente per 12-20 ore. I metodi descritti in precedenza sono tecnicamente difficili e possono essere impegnativi per chi è nuovo nel campo. Qui, viene descritto un protocollo per la preparazione, la dissezione, il montaggio e l'imaging di espianti cerebrali larvali vivi di terza stella utilizzando integratori per il corpo grasso. Vengono inoltre discussi i potenziali problemi e vengono forniti esempi su come questa tecnica può essere utilizzata.

Introduzione

La divisione cellulare asimmetrica (ACD) è il processo mediante il quale componenti subcellulari come RNA, proteine e organelli sono partizionati in modo diseguale tra le cellule figlie ^1,2. Questo processo è comunemente visto nelle cellule staminali, che subiscono ACD per dare origine a cellule figlie con diversi destini di sviluppo. Drosofila Le NB si dividono asimmetricamente per produrre una NB, che mantiene la sua staminalità, e una cellula madre gangliare (GMC). Il GMC subisce ulteriori divisioni per produrre neuroni differenzianti o glia³. Le NB che si dividono asimmetri....

Protocollo

NOTA: la Figura 1 mostra i materiali necessari per eseguire questo studio.

1. Considerazioni e preparativi per l'esperimento

1. Evitare che le larve si sovraffollano.
   NOTA: La qualità del cervello larvale espiantato è direttamente correlata alla salute e alla qualità delle larve prima della dissezione. Le larve che sono malnutrite dal sovraffollamento produrranno generalmente cervelli di qualità inferiore³⁰.
   1. Assicurarsi che non siano presenti più di 20-30 larve per piatto di tappo del pasto per evitare la malnutrizione. Esempi di questi possono essere vi....

Risultati

Dissezione e imaging del lobo cerebrale centrale NB che esprimono Pins::EGFP e Cherry::Giove
Per mostrare questo protocollo, le larve esprimono Cherry::Jupiter¹³ guidato da UAS e Pins etichettati in modo endogeno::EGFP¹⁶ (w; worGal4, UAS-cherry::jupiter/CyO; I pin::EGFP/TM6B, Tb) sono stati ripresi per 4 ore utilizzando il protocollo descritto utilizzando vetrini di imaging multi-pozzetto (Figura 5C,D). Ulte.......

Discussione

Questo protocollo delinea un approccio per l'imaging di cervelli vivi espiantati da larve di Drosophila melanogaster . Il protocollo qui descritto consente di osservare cervelli espiantati per 12-20 ore nelle giuste condizioni sperimentali. Particolare attenzione deve essere data alla preparazione dei campioni e alla progettazione degli esperimenti desiderati. Come accennato in precedenza, uno dei fattori più critici che determina la qualità del tessuto sezionato è la salute delle larve. Per ottenere la massi.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm polyethersulfone (PES) Membrane	Genesee	25-231	Vacuum-driven filters
Agar	Genesee	20-248	granulated agar
Analytical Computer	Dell	NA	Intel Xeon Gold 5222 CPU with two 3.80 GHz processors running Windows 10 on a 64-bit operating system
Bovine Growth Serum	HyClone	SH30541.02
Chambered Imaging Slides	Ibidi	80826
Confocal Microscope	Nikon	NA
Custom-machined metal slide	NA	NA	See Cabernard and Doe 2013 (Ref. 34) for specifications
Dissection Dishes	Fisher Scientific	5024343	3-well porcelain micro spot plate
Dissection Forceps	World Precision Instruments	Dumont #5
Dissection Microscope	Leica	NA
Dissection Scissors	Fine Science Tools (FST)	15003-08
Embryo collection cage	Genesee	59-100
Flypad with access to CO2 to anesthetize adult flies	Genesee	59-172
Gas-permeable membrane	YSI	98095	Gas-permeable membrane
Glass Cover Slides	Electron Microscopy Sciences	72204-03	# 1.5; 22 mm x 40 mm glass coverslips
Imaris	Oxford Instruments	NA	Alternatives: Fiji, Volocity, Aivia
Imaris File Converter	Oxford Instruments	NA
Instant Yeast	Saf-Instant	NA
Molasses	Genesee	62-117
Petri dish	Greiner Bio-One	628161	60 mm x 15 mm Petri dish
Petroleum Jelly	Vaseline	NA
Schneider's Insect Medium with L-glutamine and sodium bicarbonate liquid	Millipore Sigma	S0146
SlideBook acquisition software	3i	NA
Vacuum-Driven Filtration Unit with a 0.22 µµm PES membrane filter	Genesee Scientific, GenClone	25-231