RNA פלואורסצנטי באתרו הכלאה ללוקליזציה ארוכה של RNA לא מקודד בתאי אוסטאוסרקומה אנושיים

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה של הכלאה פלואורסצנטית באתרו של RNA כדי למקם את lncRNA בתאי אוסטאוסרקומה אנושיים.

Abstract

התפקידים החשובים של RNA ארוך שאינו מקודד (lncRNAs) בסרטן נחקרו, כגון ויסות ההתפשטות, מעבר אפיתל-מזנכימלי (EMT), הגירה, חדירה ואוטופגיה של תאים סרטניים. זיהוי לוקליזציה של lncRNA בתאים יכול לספק תובנה לגבי תפקודיהם. על ידי תכנון רצף שרשרת האנטיסנס הספציפי ל-lncRNA ואחריו תיוג בצבעים פלואורסצנטיים, ניתן ליישם הכלאה פלואורסצנטית באתרו של RNA (FISH) כדי לזהות את הלוקליזציה התאית של lncRNAs. יחד עם התפתחות המיקרוסקופ, טכניקות RNA FISH מאפשרות כעת אפילו הדמיה של lncRNA מבוטא בצורה גרועה. שיטה זו יכולה לא רק לזהות לוקליזציה של lncRNA לבד, אלא גם לזהות את הלוקליזציה של RNA אחרים, DNA, או חלבונים באמצעות צבע כפול או multicolor immunofluorescence. כאן, כללנו את הליך הפעולה הניסויי המפורט ואת אמצעי הזהירות של RNA FISH באמצעות lncRNA גרעין קטן RNA מארח גן 6 (SNHG6) בתאי אוסטאוסרקומה אנושיים (143B) כדוגמה, כדי לספק התייחסות לחוקרים שרוצים לבצע ניסויים RNA FISH, במיוחד lncRNA דגים.

Introduction

הבנתנו את הגנום האנושי הורחבה מאוד על ידי ההתקדמות האחרונה בטכנולוגיית הגנום השלם. כ-93% מהגנום האנושי ניתן לשעתוק לרנ"א, אך רק 2% מהרנ"א ניתן לתרגם לחלבונים; 98% הנותרים של RNA שאין להם פונקציית תרגום חלבונים נקראים RNA לא מקודד (ncRNA)¹. כקבוצה של רנ"א לא מקודד (ncRNAs), ncRNA ארוך (lncRNAs), המכיל מעל 200 נוקלאוטידים², משכו תשומת לב גוברת בשל מעורבותם בתהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים רבים של התאים, כגון התמיינות, בקרת מחזור, אפופטוזיס, הגירה ופלישה ^3,4,5. LncRNA ממלאים את תפקידם באמצעות מנגנונים שונים, כגון ויסות מבנה הכרומטין....

Protocol

עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים על כל החומרים, הריאגנטים והמכשירים המשמשים בפרוטוקול זה. איור 1 מראה את הפרוטוקול הכולל של דגי RNA; טבלה 1 מכילה את ההרכב של כל הפתרונות וטבלה 2 מכילה את רצפי הפריימר המשמשים בפרוטוקול זה.

1. הכנת בדיק.......

Discussion

פרוטוקול RNA FISH זה יכול לא רק לזהות לוקליזציה של lncRNA בתאים, אלא גם לזהות את הקולוקליזציה של RNAs אחרים, DNA, או חלבונים בתאים, אשר יכול לשמש גם כדי לזהות את המיקום של lncRNA ברקמות משובצות פרפין. עם זאת, הפרוטוקול הספציפי במקרים כאלה שונה מכיוון שהרקמות המשובצות בפרפין צריכות להיות בשעווה^21.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automatic cell counter	Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd	IC1000	Counting cells
Cell culture plate-12	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	3513,corning	Place the coverslips in the plate
Cell line (143B)	Cell Bank of Chinese Academy of Sciences	CRL-8303	osteosarcoma cancer cell line
Centrifuge tube (15 mL, 50 mL)	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	430790, Corning	Centrifuge the cells
Coverslips	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	abs7026	The cells are seeded on the coverslips
Cy3 label-SNHG6 DNA probe	Shanghai GenePharma Co.,Ltd	A10005	Detect SNHG6 location
DMEM media	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	LM-E1141	Cell culture medium
Dry Bath Incubator	Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd.	DKT200-2	Incubation at different high temperatures
Ethanol 100%	Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd	10009218	dehydration
Fluorescence microscope	Shanghai Waihai Biotechnology Co., LTD	Olympus BX43 equipped with a camera of Olympus U-TV0.5XC-3(SN:5J01719),olympus	Observation and positioning
Incubator	Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTD	DHP-9051	The samples were incubated at 37 °C.
Mounting Medium	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	E675004	Attach the coverslips to the slide
Shaker	Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd.	TS-8S	Washing sample
Slide	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	188105	The coverslips is placed on the slide
Triton X-100	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A600198	Permeable membrane and nuclear membrane
Trypsin (0.25%)	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	25200056, Gibco	trypsin treatment of cells
Tween-20	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A600560	detergent