RGBradford: כימות חלבונים עם מצלמת סמארטפון

Summary

מאמר זה מספק פרוטוקול לכימות חלבונים באמצעות בדיקת ברדפורד וטלפון חכם כמכשיר אנליטי. ניתן לכמת את רמות החלבון בדגימות באמצעות נתוני צבע שחולצו מתמונה של צלחת מיקרו שצולמה באמצעות טלפון חכם.

Abstract

כימות חלבונים הוא הליך חיוני במחקר מדעי החיים. בין מספר שיטות אחרות, מבחן ברדפורד הוא אחד הנפוצים ביותר. בגלל נפוצותו, המגבלות והיתרונות של מבחן ברדפורד דווחו באופן ממצה, כולל מספר שינויים של השיטה המקורית כדי לשפר את הביצועים שלה. אחד השינויים בשיטה המקורית הוא השימוש במצלמת סמארטפון כמכשיר אנליטי. תוך ניצול שלוש הצורות של צבע Coomassie Brilliant Blue הקיימות בתנאים של מבחן ברדפורד, מאמר זה מתאר כיצד לכמת במדויק חלבון בדגימות באמצעות נתוני צבע שחולצו מתמונה אחת של מיקרו-לוחית. לאחר ביצוע הבדיקה במיקרו-לוחית, התמונה מצולמת באמצעות מצלמת סמארטפון, ונתוני צבע RGB מופקים מהתמונה באמצעות יישום תוכנה חינמי וקוד פתוח לניתוח תמונות. לאחר מכן, היחס בין עוצמה כחולה לירוקה (בסולם RGB) של דגימות עם ריכוזים לא ידועים של חלבון משמש לחישוב תכולת החלבון בהתבסס על עקומה סטנדרטית. לא נצפה הבדל משמעותי בין ערכים המחושבים באמצעות נתוני צבע RGB לבין ערכים המחושבים באמצעות נתוני ספיגה רגילים.

Introduction

ללא קשר לשימוש במורד הזרם (למשל, ELISA, קינטיקה של אנזימים, כתמים מערביים, טיהור חלבונים וספקטרומטריית מסות), כימות חלבונים חיוני לניתוח מדויק במעבדות מדעי החיים. בנוסף לשימוש בהם כקריאות משניות (כלומר, כדי לחשב רמות יחסיות של אנליטים לכל מסת חלבון), רמות חלבון במדגם יכולות להיות גם הפלט הרצוי עצמו. לדוגמה, אפשר להתעניין ברמות החלבון במשאבי מזון¹ או בשתן². ישנן שיטות רבות זמינות למדידת ריכוז החלבון בדגימות³, כולל קריאות ספיגת UV ישירות⁴, כלציה חלבון-נחושת ^5,6, בדיקות קולורימטריות קושרות צבע חלבון⁷, ומבחני פלורסנט קו....

Protocol

1. הכנת מגיב בדיקת חלבון ברדפורד

1. להמיס 100 מ"ג של Coomassie Brilliant Blue G באתנול של 50 מ"ל 95% (עם V). מערבבים עד ש-Coomassie Brilliant Blue G מומס לחלוטין.
   אזהרה: אתנול דליק וגורם לגירוי בעיניים. הימנעו מלהבות והשתמשו במשקפי מגן.
2. לתמיסה הקודמת, הוסף 100 מ"ל של 85% (w/v) חומצה זרחתית בזהירות.
   אזהרה: חומצ?.......

Discussion

מאמר זה מתאר את RGBradford, שיטה המשתמשת במצלמת סמארטפון כדי להקליט נתונים מבדיקת חלבון ברדפורד, לחלץ נתוני צבע ולכמת במדויק את רמות החלבונים בדגימות ביולוגיות כפי שתואר במקור^{לאחרונה 20}. הבדל אחד משיטת RGBradford המקורית הוא שכאן נעשה שימוש בהליך לקבלת נתוני צבע באופן אוטומטי עם תוסף Ima.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well flat-bottom polystyrene microtiter plates	Jet Biofil, Guangzhou, China	TCP011096	Any flat-bottom microplate compativle with optical reading will suffice.
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	A2153
Coomassie Brilliant Blue G	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	B0770
Ethyl alcohol
iPhone 11	Apple	MWM02BR/A	Can be substituted with other smartphone equiped with a camera
iPhone 14 Pro	Apple	N/A
Phosphoric acid	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	695017
Redmi Note 9 Pro	XIAOMI	N/A
S22 Ultra	Samsung	N/A
SpectraMax 384 Plus. Microplate reader.	Molecular Devices, San Jose, CA	PLUS 384	Any microplate reader capable of reading at 450 nm and 590 nm will work. This is optional. The method was actually created to dismiss the need of a microplate reader.