Экспресс-цитотоксичность рецептора химерного антигена Jurkat in vitro с использованием флуоресцентной визуализации

Summary

Протокол оценки количественного уничтожения опухолевых клеток клетками Юрката, экспрессирующими химерный антигенный рецептор (CAR), нацеленный на одиночный опухолевый антиген. Этот протокол может быть использован в качестве скрининговой платформы для быстрой оптимизации шарнирных конструкций CAR перед подтверждением в Т-клетках периферической крови.

Abstract

Т-клетки химерного антигенного рецептора (CAR) находятся на переднем крае онкологии. CAR состоит из целевого домена (обычно фрагмента переменной цепи, scFv) с сопутствующим внутрицепочечным линкером, за которым следуют шарнирный, трансмембранный и костимулирующий домены. Модификация внутрицепочечного линкера и шарнирного домена может оказать существенное влияние на CAR-опосредованное убийство. Принимая во внимание множество различных вариантов для каждой части конструкции CAR, существует большое количество перестановок. Изготовление CAR-T-клеток является трудоемким и дорогостоящим процессом, а изготовление и тестирование многих конструкций требует больших временных и материальных затрат. Этот протокол описывает платформу для быстрой оценки шарнирно-оптимизированных конструкций CAR в ячейках Jurkat (CAR-J). Клетки Jurkat представляют собой иммортализированную линию Т-клеток с высоким поглощением лентивируса, что обеспечивает эффективную трансдукцию CAR. Здесь мы представляем платформу для быстрой оценки CAR-J с помощью флуоресцентного тепловизора с последующим подтверждением цитолиза в Т-клетках, полученных из PBMC.

Introduction

По данным^{Национального института рака}, с 2017 года CAR-T-клеточная терапия показала большие перспективы при гематологических злокачественных новообразованиях, о чем свидетельствуют 6 одобренных FDA продуктов CAR-T. Существует множество CAR-T-клеток, проводимых в клинических испытаниях для воздействия на солидные опухоли. Разработка новых мишеней для CAR и оптимизация конструкции CAR имеют жизненно важное значение для эффективности CAR-T-клеток. Выбор идеальной конструкции CAR для каждого применения имеет важное значение для точного нацеливания на опухоль-ассоциированные антигены (ТАА) при одновременном избежании низких уровней экспрессии ТАА в ....

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Все работы с клеточными культурами выполняются в шкафу биобезопасности с лабораторным халатом, перчатками и в соответствии со стандартными асептическими методами.

1. Генерация CAR, выражающая юркаты (CAR-J)

1. Приобретите ячейки Jurkat, клон E6-1 от ATCC. Раз?.......

Discussion

Предложен экспресс-метод оценки таргет-специфической цитолитической активности, индуцированной экспрессией CAR в клетках Jurkat. Все конструкции CAR имеют один и тот же scFv, но разные шарнирные и трансмембранные домены, которые, как было показано, влияют на активность CAR-T-клеток¹³.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL Conical Tube (Sterile)	Midwest Scientific	#C15B	Any similar will work
50 mL Conical Tube (Sterile)	Thermo Scientific	339652	Any similar will work
Black/Clear 96 well plate	Falcon	353219	Celligo has a list of compatible plates
Celigo 4 Channel Imaging Cytomenter	Nexcelcom Bioscience	200-BFFL-5C	Any similar will work
Celigo Software	Nexcelcom Bioscience	Version 5.3.0.0	Any similar will work
Cell Culture Incubator	Thermo Scientific	HeraCell 160i	Any similar will work
Cell Culture Treated Flasks (T75, various sizes, Sterile)	TPP	90076	Any similar will work
CFSE	Tonbo	13-0850-U500	Any similar will work
Cytek Muse Cell Analyzer	Cytek	0500-3115	Any similar will work
DMEM	Gibco	11995-040	Any similar will work
FBS	Gemini bio-products	900-108	Any similar will work
Flow Cytometer	Cytek, BD, etc	Aurora, LSR II, etc	Any similar will work
FlowJo Sortware	Becton Dickinson & Company	Version 10.7.1	Any similar will work
Fluorobrite DMEM	Gibco	A18967-01	Any similar will work
GraphPad Software	GraphPad	Version 9.3.1 (471)	Any similar will work
Multichanel Pipette	Thermo Scientific	Finnpipette F2	Any similar will work
PBS	Gibco	10010-031	Any similar will work
PenStrep	Gibco	15070-063	Any similar will work
Pipette tips (Sterile, filtered, 1 mL, Various sizes)	Pr1ma	PR-1250RK-FL, etc	Any similar will work
Pipettors	Thermo Scientific	Finnpipette F2	Any similar will work
Propidium Iodide	Invitrogen	P1304MP	Any similar will work
RPMI	Corning	10-041-cv	Any similar will work
Serological Pipette Aid	Drummond Scientific	4-000-105	Any similar will work
Serological Pipettes (Sterile, various sizes)	Pr1ma	PR-SERO-25, etc	Any similar will work
Sodium Pyruvate	Corning	25-000-CI	Any similar will work
Sterile Reservoirs	Midwest Scientific	RESE-2000	Any similar will work
Table top centrifuge	Eppendorf	5810R	Any similar will work