Utilisation de l’imagerie STED de cellules vivantes pour visualiser l’ultrastructure de la membrane interne mitochondriale dans des modèles de cellules neuronales

Les mitochondries jouent de nombreux rôles essentiels dans la cellule, notamment la production d’énergie, la régulation de l’homéostasie du Ca²⁺ , la biosynthèse des lipides et la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS). Ces processus médiés par les mitochondries jouent des rôles spécialisés dans les neurones, coordonnant le métabolisme aérobie pour répondre aux besoins énergétiques élevés de ces cellules, modulant la signalisation Ca²⁺ , fournissant des lipides pour la croissance et la régénération des axones et ajustant la production de ROS pour le développement et la fonction neuronaux. Le dysfonctionnement mitochondrial est donc un facteur central des maladies neurodégénératives. La structure et la fonction mitochondriales sont inextricablement liées. La membrane interne morphologiquement complexe avec des plis structurels appelés crêtes abrite de nombreux systèmes moléculaires qui exécutent les processus de signature de la mitochondrie. Les caractéristiques architecturales de la membrane interne sont ultrastructurales et donc trop petites pour être visualisées par la microscopie résolue traditionnelle limitée par diffraction. Ainsi, la plupart des connaissances sur l’ultrastructure mitochondriale proviennent de la microscopie électronique sur des échantillons fixes. Cependant, les technologies émergentes de la microscopie à fluorescence à super-résolution offrent désormais une résolution allant jusqu’à quelques dizaines de nanomètres, ce qui permet de visualiser les caractéristiques ultrastructurales des cellules vivantes. L’imagerie à super-résolution offre donc une capacité sans précédent à imager directement les détails fins de la structure mitochondriale, de la distribution des protéines à l’échelle nanométrique et de la dynamique des crêtes, fournissant ainsi de nouvelles informations fondamentales qui relient les mitochondries à la santé et à la maladie humaines. Ce protocole présente l’utilisation de la microscopie à super-résolution à déplétion par émission stimulée (STED) pour visualiser l’ultrastructure mitochondriale de cellules vivantes de neuroblastome humain et de neurones primaires de rat. Cette procédure est organisée en cinq sections : (1) croissance et différenciation de la lignée cellulaire SH-SY5Y, (2) isolement, placage et croissance des neurones primaires de l’hippocampe du rat, (3) procédures de coloration des cellules pour l’imagerie STED vivante, (4) procédures pour les expériences STED sur cellules vivantes utilisant un microscope STED comme référence, et (5) conseils pour la segmentation et le traitement d’images à l’aide d’exemples pour mesurer et quantifier les caractéristiques morphologiques de la membrane interne.