Verwendung von Lebendzell-STED-Bildgebung zur Visualisierung der mitochondrialen Innenmembran-Ultrastruktur in neuronalen Zellmodellen

Mitochondrien spielen viele wesentliche Rollen in der Zelle, darunter die Energieproduktion, die Regulierung der^Ca2+ -Homöostase, die Lipidbiosynthese und die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS). Diese Mitochondrien-vermittelten Prozesse übernehmen spezialisierte Rollen in Neuronen, koordinieren den aeroben Stoffwechsel, um den hohen Energiebedarf dieser Zellen zu decken, modulieren die Ca²⁺ -Signalgebung, liefern Lipide für das Wachstum und die Regeneration von Axonen und stimmen die ROS-Produktion auf die neuronale Entwicklung und Funktion ab. Die mitochondriale Dysfunktion ist daher ein zentraler Treiber bei neurodegenerativen Erkrankungen. Struktur und Funktion der Mitochondrien sind untrennbar miteinander verbunden. Die morphologisch komplexe innere Membran mit strukturellen Infolds, die Cristae genannt werden, beherbergt viele molekulare Systeme, die die charakteristischen Prozesse des Mitochondriums ausführen. Die architektonischen Merkmale der inneren Membran sind ultrastrukturell und daher zu klein, um mit herkömmlicher beugungsbegrenzter aufgelöster Mikroskopie sichtbar gemacht zu werden. Daher stammen die meisten Erkenntnisse über die mitochondriale Ultrastruktur aus der Elektronenmikroskopie an fixierten Proben. Neue Technologien in der superauflösenden Fluoreszenzmikroskopie bieten jedoch jetzt eine Auflösung von bis zu zehn Nanometern und ermöglichen die Visualisierung ultrastruktureller Merkmale in lebenden Zellen. Die hochauflösende Bildgebung bietet daher eine noch nie dagewesene Möglichkeit, feine Details der mitochondrialen Struktur, der nanoskaligen Proteinverteilungen und der Cristae-Dynamik direkt abzubilden, was grundlegende neue Erkenntnisse liefert, die Mitochondrien mit der menschlichen Gesundheit und Krankheit in Verbindung bringen. Dieses Protokoll stellt die Verwendung von hochauflösender Mikroskopie mit stimulierter Emissionsverarmung (STED) vor, um die mitochondriale Ultrastruktur von lebenden menschlichen Neuroblastomzellen und primären Rattenneuronen zu visualisieren. Dieses Verfahren ist in fünf Abschnitte unterteilt: (1) Wachstum und Differenzierung der SH-SY5Y-Zelllinie, (2) Isolierung, Plattierung und Wachstum von primären Hippocampusneuronen der Ratte, (3) Verfahren zur Färbung von Zellen für die lebende STED-Bildgebung, (4) Verfahren für STED-Experimente mit lebenden Zellen unter Verwendung eines STED-Mikroskops als Referenz und (5) Anleitung zur Segmentierung und Bildverarbeitung anhand von Beispielen zur Messung und Quantifizierung morphologischer Merkmale der inneren Membran.