שימוש בדימות STED של תאים חיים כדי להמחיש את מבנה העל של הממברנה הפנימית של המיטוכונדריה במודלים של תאים עצביים

מיטוכונדריה ממלאים תפקידים חיוניים רבים בתא, כולל ייצור אנרגיה, ויסות הומאוסטזיס Ca²⁺ , ביוסינתזה של שומנים וייצור מיני חמצן תגובתי (ROS). תהליכים אלה בתיווך מיטוכונדריה לוקחים על עצמם תפקידים מיוחדים בנוירונים, תיאום חילוף החומרים האירובי כדי לענות על דרישות האנרגיה הגבוהות של תאים אלה, ויסות איתות Ca²⁺ , אספקת שומנים לצמיחה והתחדשות של אקסונים, וכוונון ייצור ROS להתפתחות ותפקוד עצביים. לכן, תפקוד לקוי של המיטוכונדריה הוא גורם מרכזי במחלות נוירודגנרטיביות. המבנה והתפקוד של המיטוכונדריה קשורים קשר בל יינתק. הממברנה הפנימית המורכבת מורפולוגית עם קפלים מבניים הנקראים cristae מכילה מערכות מולקולריות רבות המבצעות את תהליכי החתימה של המיטוכונדריה. המאפיינים האדריכליים של הממברנה הפנימית הם אולטרה-סטרוקטורליים ולכן קטנים מכדי שניתן יהיה לדמיין אותם במיקרוסקופ מסורתי מוגבל עקיפה. לפיכך, רוב התובנות על אולטרה-מבנה מיטוכונדריאלי הגיעו ממיקרוסקופ אלקטרונים על דגימות קבועות. עם זאת, טכנולוגיות מתפתחות במיקרוסקופ פלואורסצנטי ברזולוציית על מספקות כיום רזולוציה של עד עשרות ננומטרים, ומאפשרות הדמיה של תכונות אולטרה-מבניות בתאים חיים. הדמיה ברזולוציית על מציעה אפוא יכולת חסרת תקדים לצלם ישירות פרטים קטנים של מבנה המיטוכונדריה, התפלגות חלבונים ננומטרית ודינמיקה של קריסטה, ומספקת תובנות בסיסיות חדשות הקושרות מיטוכונדריה לבריאות האדם ולמחלות. פרוטוקול זה מציג את השימוש במיקרוסקופ ברזולוציית על של דלדול פליטה מגורה (STED) כדי להמחיש את מבנה העל של המיטוכונדריה של תאי נוירובלסטומה אנושיים חיים ונוירונים ראשוניים של חולדות. הליך זה מאורגן בחמישה חלקים: (1) גדילה והתמיינות של קו תאי SH-SY5Y, (2) בידוד, ציפוי וגדילה של נוירונים ראשוניים בהיפוקמפוס של חולדה, (3) נהלים להכתמת תאים עבור דימות STED חי, (4) הליכים לניסויי STED של תאים חיים באמצעות מיקרוסקופ STED לעיון, ו-(5) הדרכה לסגמנטציה ועיבוד תמונה באמצעות דוגמאות למדידה וכימות של תכונות מורפולוגיות של הממברנה הפנימית.