Utilizzo dell'imaging STED su cellule vive per visualizzare l'ultrastruttura della membrana interna mitocondriale in modelli di cellule neuronali

I mitocondri svolgono molti ruoli essenziali nella cellula, tra cui la produzione di energia, la regolazione dell'omeostasi di Ca²⁺ , la biosintesi dei lipidi e la produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS). Questi processi mediati dai mitocondri assumono ruoli specializzati nei neuroni, coordinando il metabolismo aerobico per soddisfare le elevate richieste energetiche di queste cellule, modulando la segnalazione di Ca²⁺ , fornendo lipidi per la crescita e la rigenerazione degli assoni e regolando la produzione di ROS per lo sviluppo e la funzione neuronale. La disfunzione mitocondriale è quindi un fattore centrale nelle malattie neurodegenerative. La struttura e la funzione mitocondriale sono indissolubilmente legate. La membrana interna morfologicamente complessa con pieghe strutturali chiamate cristae ospita molti sistemi molecolari che eseguono i processi di firma del mitocondrio. Le caratteristiche architettoniche della membrana interna sono ultrastrutturali e quindi troppo piccole per essere visualizzate dalla microscopia tradizionale a risoluzione limitata alla diffrazione. Pertanto, la maggior parte delle intuizioni sull'ultrastruttura mitocondriale sono venute dalla microscopia elettronica su campioni fissi. Tuttavia, le tecnologie emergenti nella microscopia a fluorescenza a super-risoluzione ora forniscono una risoluzione fino a decine di nanometri, consentendo la visualizzazione delle caratteristiche ultrastrutturali nelle cellule vive. L'imaging a super-risoluzione offre quindi una capacità senza precedenti di visualizzare direttamente i dettagli fini della struttura mitocondriale, delle distribuzioni proteiche su scala nanometrica e delle dinamiche delle cristae, fornendo nuove intuizioni fondamentali che collegano i mitocondri alla salute e alle malattie umane. Questo protocollo presenta l'uso della microscopia a super-risoluzione a deplezione di emissione stimolata (STED) per visualizzare l'ultrastruttura mitocondriale di cellule vive di neuroblastoma umano e neuroni primari di ratto. Questa procedura è organizzata in cinque sezioni: (1) crescita e differenziazione della linea cellulare SH-SY5Y, (2) isolamento, placcatura e crescita dei neuroni primari dell'ippocampo di ratto, (3) procedure per la colorazione delle cellule per l'imaging di STED vive, (4) procedure per esperimenti STED su cellule vive utilizzando un microscopio STED come riferimento e (5) guida per la segmentazione e l'elaborazione delle immagini utilizzando esempi per misurare e quantificare le caratteristiche morfologiche della membrana interna.