生細胞STEDイメージングを用いた神経細胞モデルにおけるミトコンドリア内膜の微細構造の可視化

ミトコンドリアは、エネルギー産生、^Ca2+ ホメオスタシスの調節、脂質生合成、活性酸素種(ROS)の産生など、細胞内で多くの重要な役割を果たしています。これらのミトコンドリアを介したプロセスは、ニューロンにおいて特殊な役割を担い、これらの細胞の高エネルギー需要を満たすために好気性代謝を調整し、Ca²⁺ シグナル伝達を調節し、軸索の成長と再生のための脂質を供給し、ニューロンの発達と機能のためにROS産生を調整します。したがって、ミトコンドリアの機能不全は神経変性疾患の中心的な要因です。ミトコンドリアの構造と機能は密接に関連しています。形態学的に複雑な内膜は、クリステと呼ばれる構造的な折り目を持ち、ミトコンドリアの特徴的なプロセスを実行する多くの分子システムを持っています。内膜の構造的特徴は超微細構造であるため、従来の回折限界分解顕微鏡では小さすぎて可視化できません。したがって、ミトコンドリアの超微細構造に関するほとんどの洞察は、固定されたサンプルの電子顕微鏡から得られています。しかし、超解像蛍光顕微鏡の新技術により、数十ナノメートルまでの分解能が得られ、生細胞の微細構造の特徴を可視化できるようになりました。したがって、超解像イメージングは、ミトコンドリア構造、ナノスケールのタンパク質分布、およびクリステの動態の細部を直接画像化する前例のない能力を提供し、ミトコンドリアを人間の健康や病気に結び付ける基本的な新しい洞察を提供します。このプロトコルは生きている人間のneuroblastomaのセルおよび第一次ラットのニューロンのミトコンドリアの微細構造を視覚化するのに刺激された放出の枯渇(STED)の超解像の顕微鏡検査の使用を示す。この手順は、(1)SH-SY5Y細胞株の増殖と分化、(2)初代ラット海馬ニューロンの単離、プレーティング、および増殖、(3)ライブSTEDイメージングのための細胞の染色手順、(4)参照用のSTED顕微鏡を使用した生細胞STED実験の手順、および(5)内膜の形態学的特徴を測定および定量するための例を使用したセグメンテーションと画像処理のガイダンスの5つのセクションで構成されています。