Использование визуализации STED живых клеток для визуализации ультраструктуры внутренней мембраны митохондрий в моделях нейрональных клеток

Митохондрии играют много важных ролей в клетке, включая производство энергии, регуляцию гомеостаза^Ca2+ , биосинтез липидов и производство активных форм кислорода (АФК). Эти митохондриальные опосредованные процессы берут на себя специализированные роли в нейронах, координируя аэробный метаболизм для удовлетворения высоких энергетических потребностей этих клеток, модулируя передачу сигналов Ca2⁺ , обеспечивая липиды для роста и регенерации аксонов и настраивая производство АФК для развития и функционирования нейронов. Таким образом, митохондриальная дисфункция является основным фактором нейродегенеративных заболеваний. Структура и функции митохондрий неразрывно связаны. Морфологически сложная внутренняя мембрана со структурными складками, называемыми кристами, содержит множество молекулярных систем, которые выполняют сигнатурные процессы митохондрии. Архитектурные особенности внутренней мембраны являются ультраструктурными и, следовательно, слишком малы, чтобы их можно было визуализировать с помощью традиционной дифракционно-ограниченной разрешающей микроскопии. Таким образом, большая часть информации о ультраструктуре митохондрий была получена с помощью электронной микроскопии на фиксированных образцах. Тем не менее, новые технологии флуоресцентной микроскопии сверхвысокого разрешения в настоящее время обеспечивают разрешение до десятков нанометров, что позволяет визуализировать ультраструктурные особенности живых клеток. Таким образом, визуализация со сверхвысоким разрешением предлагает беспрецедентную возможность прямого изображения мельчайших деталей митохондриальной структуры, наноразмерного распределения белков и динамики кристаллов, обеспечивая фундаментальные новые идеи, которые связывают митохондрии со здоровьем и болезнями человека. Этот протокол представляет собой использование микроскопии со сверхвысоким разрешением со стимулированным истощением эмиссии (STED) для визуализации митохондриальной ультраструктуры живых клеток нейробластомы человека и первичных нейронов крыс. Эта процедура состоит из пяти разделов: (1) рост и дифференцировка клеточной линии SH-SY5Y, (2) выделение, покрытие и рост первичных нейронов гиппокампа крысы, (3) процедуры окрашивания клеток для визуализации живых ЗППП, (4) процедуры экспериментов с живыми клетками, ЗППП с использованием микроскопа ЗПТП для справки, и (5) руководство по сегментации и обработке изображений с использованием примеров для измерения и количественной оценки морфологических особенностей внутренней мембраны.