Uso de imágenes de células vivas de STED para visualizar la ultraestructura de la membrana interna mitocondrial en modelos de células neuronales

Las mitocondrias desempeñan muchas funciones esenciales en la célula, incluida la producción de energía, la regulación de la homeostasis de Ca²⁺ , la biosíntesis de lípidos y la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS). Estos procesos mediados por mitocondrias asumen funciones especializadas en las neuronas, coordinando el metabolismo aeróbico para satisfacer las altas demandas de energía de estas células, modulando la señalización de Ca²⁺ , proporcionando lípidos para el crecimiento y la regeneración de axones y ajustando la producción de ROS para el desarrollo y la función neuronal. Por lo tanto, la disfunción mitocondrial es un factor central en las enfermedades neurodegenerativas. La estructura y la función mitocondrial están inextricablemente vinculadas. La membrana interna morfológicamente compleja con pliegues estructurales llamados crestas alberga muchos sistemas moleculares que realizan los procesos característicos de la mitocondria. Las características arquitectónicas de la membrana interna son ultraestructurales y, por lo tanto, demasiado pequeñas para ser visualizadas por la microscopía tradicional resuelta por difracción limitada. Por lo tanto, la mayoría de los conocimientos sobre la ultraestructura mitocondrial provienen de la microscopía electrónica en muestras fijas. Sin embargo, las tecnologías emergentes en microscopía de fluorescencia de superresolución ahora proporcionan una resolución de hasta decenas de nanómetros, lo que permite la visualización de características ultraestructurales en células vivas. Por lo tanto, las imágenes de superresolución ofrecen una capacidad sin precedentes para obtener imágenes directas de detalles finos de la estructura mitocondrial, las distribuciones de proteínas a nanoescala y la dinámica de las crestas, lo que proporciona nuevos conocimientos fundamentales que vinculan las mitocondrias con la salud y la enfermedad humanas. Este protocolo presenta el uso de microscopía de superresolución de agotamiento de emisiones estimuladas (STED) para visualizar la ultraestructura mitocondrial de células vivas de neuroblastoma humano y neuronas primarias de rata. Este procedimiento está organizado en cinco secciones: (1) crecimiento y diferenciación de la línea celular SH-SY5Y, (2) aislamiento, siembra y crecimiento de neuronas primarias del hipocampo de rata, (3) procedimientos para teñir células para obtener imágenes de STED vivas, (4) procedimientos para experimentos de STED de células vivas utilizando un microscopio de STED como referencia, y (5) orientación para la segmentación y el procesamiento de imágenes utilizando ejemplos para medir y cuantificar las características morfológicas de la membrana interna.