Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

לתאי סטרומה מזנכימליים שמקורם בשומן (AdMSCs) יש תכונות אימונומודולטוריות חזקות השימושיות לטיפול במחלות הקשורות לדלקת. אנו מדגימים כיצד לבודד ולגדל בתרבית של AdMSCs ותאי גליה מעורבים ראשוניים, לעורר AdMSCs כדי לווסת גנים אנטי דלקתיים וגורמי גדילה, להעריך הגירה של AdMSCs, ותרבית משותפת של AdMSCs עם גליה מעורבת ראשונית נגועה בפריון.

Abstract

תאי סטרומה מזנכימליים (MSCs) הם רגולטורים רבי עוצמה של דלקת באמצעות ייצור ציטוקינים אנטי דלקתיים, כימוקינים וגורמי גדילה. תאים אלה מראים יכולת לווסת דלקת עצבית בהקשר של מחלות נוירודגנרטיביות כגון מחלת פריון והפרעות אחרות בקיפול שגוי של חלבונים. מחלות פריון יכולות להיות ספורדיות, נרכשות או גנטיות; הם יכולים לנבוע מקיפול שגוי וצבירה של חלבון פריון במוח. מחלות אלה הן תמיד קטלניות, ללא טיפולים זמינים.

אחד הסימנים המוקדמים ביותר למחלה הוא הפעלת אסטרוציטים ותאי מיקרוגליה ודלקת קשורה, המתרחשת לפני צבירת פריונים הניתנים לגילוי ואובדן עצבי; לכן, תכונות אנטי דלקתיות רגולטוריות של MSCs ניתן לקצור לטיפול astrogliosis במחלת פריון. לאחרונה הראינו כי MSCs שמקורם בשומן (AdMSCs) בתרבית משותפת עם תאי BV2 או גליה מעורבת ראשונית מפחיתים דלקת הנגרמת על ידי פריונים באמצעות איתות פרקריני. מאמר זה מתאר טיפול אמין באמצעות AdMSCs מגורה כדי להפחית דלקת הנגרמת על ידי פריונים.

אוכלוסייה הטרוזיגוטית של AdMSCs יכולה בקלות להיות מבודדת מרקמת שומן מורין ולהרחיב בתרבית. גירוי תאים אלה עם ציטוקינים דלקתיים משפר את יכולתם גם לנדוד לכיוון הומוגנט מוחי נגוע פריונים וגם לייצר מודולטורים אנטי דלקתיים בתגובה. יחד, טכניקות אלה יכולות לשמש לחקר הפוטנציאל הטיפולי של MSCs על זיהום פריונים וניתן להתאים אותן לקיפול שגוי של חלבונים אחרים ולמחלות נוירו-דלקתיות.

Introduction

דלקת גליה ממלאת תפקיד מפתח במגוון מחלות נוירודגנרטיביות, כולל פרקינסון, אלצהיימר ומחלות פריונים. למרות שצבירה חריגה של חלבונים מיוחסת לחלק גדול מפתוגנזה של מחלות וניוון עצבי, תאי גליה גם ממלאים תפקיד בהחמרת 1,2,3 זה. לכן, התמקדות בדלקת הנגרמת על ידי גליה היא גישה טיפולית מבטיחה. במחלת פריונים, חלבון הפריון התאי (PrPC) מתקפל בטעות לחלבון פריון הקשור למחלה (PrPSc), היוצר אוליגומרים וצברים ומשבש את ההומאוסטזיס במוח 4,5,6.

אחד הסימנים המו....

Protocol

עכברים גודלו והוחזקו ב- Lab Animal Resources של מדינת קולורדו, שהוסמך על ידי האגודה להערכה והסמכה של Lab Animal Care International, בהתאם לפרוטוקול #1138, שאושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת קולורדו.

1. בידוד והדבקת גליה מעורבת קליפת המוח הראשונית עם פריונים

    .......

Representative Results

גירוי AdMSCs עם TNFα או אינטרפרון-גמא (IFNγ) במשך 24 שעות גורם לשינויים בביטוי של מולקולות אנטי דלקתיות וגורמי גדילה. טיפול ב- AdMSCs עם TNFα או אינטרפרון-גמא (IFNγ) מגביר את הגן המגורה TNF 6 (TSG-6) mRNA, ואילו TNFα, אך לא IFNγ, גורם לעלייה בשינוי גורם גדילה בטא-1 (TGFβ-1) mRNA. גירוי עם TNFα או IFNγ גורם לעלייה בגורם .......

Discussion

כאן אנו מדגימים פרוטוקול אמין וזול יחסית להערכת ההשפעות של תאי סטרומה מזנכימליים שמקורם בשומן (AdMSC) בהפחתת דלקת הנגרמת על ידי פריונים במודל תאי גלייה. ניתן בקלות לבודד ולהרחיב את AdMSCs בתרבית לשימוש תוך שבוע אחד בלבד. פרוטוקול זה מייצר באופן עקבי אוכלוסייה הטרולוגית של תאים המבטאים סמנים הת?.......

Acknowledgements

המחברים מודים ל-Lab Animal Resources על גידול בעלי החיים. מקורות המימון שלנו לכתב יד זה כוללים את קרן בוטצ'ר, קרן מרפי טרנר, מכללת CSU לרפואה וטרינרית ומועצת המחקר של המכללה למדעים ביו-רפואיים. איור 2A, איור 2C ואיור 3A נוצרו עם BioRender.com.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% TrypsinCytivaSH30042.01
5 mL serological pipetsCelltreat229005B
6-well tissue culture platesCelltreat229106
10 cm cell culture dishesPeak SerumPS-4002
10 ml serological pipetsCelltreat229210
15 mL conical tubesCelltreat667015B
50 mL conical tubesCelltreat667050B
BV2 microglia cell lineAcceGen BiotechABC-TC212S
Cell lifterBiologix Research Company70-2180
Crystal violetElectron Microscopy Sciences 12785
DispaseThermo Scientific17105041
DMEM/F12Caisson LabsDFL14-500ML
DNase-ISigma Aldrich11284932001
Essential amino acidsThermo Scientific11130051
Ethanol (100%)EMD MilliporeEX0276-1
Fetal bovine serum (heat inactivated)Peak SerumPS-FB4Can be purchased as heat inactivated or inactivated in the laboratory
FormaldehydeEMD Millipore1.04003.1000
Glass 10 mL serological pipetCorning 7077-10N
Hank’s Balances Salt SolutionSigma AldrichH8264-500ML
Hemocytometer/Neubauer ChamberDaiggerHU-3100
High Glucose DMEMCytivaSH30022.01
low glucose DMEM containing L-glutamineCytivaSH30021.01
MEM/EBSSCytivaSH30024.FS
non-essential amino acidsSigma-AldrichM7145-100M
Paraformaldehyde (16%)MP Biomedicals219998320
Penicillin/streptomycin/neomycinSigma-AldrichP4083-100ML
Phosphate buffered salineCytiva SH30256.01
Recombinant Mouse IFN-gamma ProteinR&D Systems485-MI
Recombinant Mouse TNF-alpha (aa 80-235) Protein, CFR&D Systems410-MT
RNeasy mini kitQiagen74104
SigmacoteSigma AldrichSL2-100MLCoat inside of glass pipets by aspirating up and down twice in Sigmacote and allowing to dry thoroughly. Wrap in aluminum foil and autoclave pipets 24 h later.
StemxymeWorthington Biochemical CorporationLS004106Collagenase/Dispase mixture
Sterile, individually wrapped cotton swabPuritan Medical 25-8061WC
Thincert Tissue Culture Inserts, 24 well, Pore Size=8 µmGreiner Bio-One662638
Thincert Tissue Culture Inserts, 6 well, Pore Size=0.4 µmGreiner Bio-One657641

References

  1. Liddelow, S. A., et al. Neurotoxic reactive astrocytes are induced by activated microglia. Nature. 541 (7638), 481-487 (2017).
  2. Smith, H. L., et al. Astrocyte unf....

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved