Fenotypische profilering van dopaminerge neuronen in de middenhersenen van menselijke stamcellen

De ziekte van Parkinson (PD) is gekoppeld aan een reeks celbiologische processen die dopaminerge (mDA) neuronenverlies in de middenhersenen veroorzaken. Veel van de huidige in vitro PD-cellulaire modellen missen complexiteit en houden geen rekening met meerdere fenotypes. Fenotypische profilering in humaan geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC)-afgeleide mDA-neuronen kan deze tekortkomingen aanpakken door tegelijkertijd een reeks neuronale fenotypes in een PD-relevant celtype parallel te meten. Hier beschrijven we een protocol voor het verkrijgen en analyseren van fenotypische profielen van in de handel verkrijgbare menselijke mDA-neuronen. Een neuronspecifiek fluorescerend kleuringspaneel wordt gebruikt om de nucleaire, α-synucleïne, tyrosinehydroxylase (TH) en microtubuli-geassocieerd proteïne 2 (MAP2) gerelateerde fenotypes te visualiseren. Het beschreven fenotypische profileringsprotocol is schaalbaar omdat het gebruik maakt van platen met 384 putjes, automatische vloeistofverwerking en high-throughput microscopie. Het nut van het protocol wordt geïllustreerd met behulp van gezonde donor mDA-neuronen en mDA-neuronen die de PD-gekoppelde G2019S-mutatie dragen in het Leucine-rijke repeat kinase 2 (LRRK2)-gen. Beide cellijnen werden behandeld met de LRRK2-kinaseremmer PFE-360 en fenotypische veranderingen werden gemeten. Daarnaast laten we zien hoe multidimensionale fenotypische profielen kunnen worden geanalyseerd met behulp van clustering of machine learning-gestuurde gesuperviseerde classificatiemethoden. Het beschreven protocol zal vooral interessant zijn voor onderzoekers die werken aan het modelleren van neuronale ziekten of het bestuderen van effecten van chemische verbindingen in menselijke neuronen.