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Questo protocollo descrive la coltura cellulare di neuroni dopaminergici del mesencefalo umano, seguita da colorazione immunologica e generazione di profili fenotipici neuronali da immagini microscopiche acquisite ad alto contenuto che consentono l'identificazione di variazioni fenotipiche dovute a modulazioni genetiche o chimiche.
Il morbo di Parkinson (PD) è legato a una serie di processi biologici cellulari che causano la perdita di neuroni dopaminergici del mesencefalo (mDA). Molti attuali modelli cellulari di PD in vitro mancano di complessità e non tengono conto di fenotipi multipli. Il profilo fenotipico nei neuroni mDA derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC) può affrontare queste carenze misurando simultaneamente una serie di fenotipi neuronali in un tipo di cellula rilevante per la PD in parallelo. In questo articolo, descriviamo un protocollo per ottenere e analizzare i profili fenotipici da neuroni mDA umani disponibili in commercio. Un pannello di colorazione fluorescente specifico per i neuroni viene utilizzato per visualizzare i fenotipi correlati alla proteina nucleare, alla α-sinucleina, alla tirosina idrossilasi (TH) e alla proteina 2 associata ai microtubuli (MAP2). Il protocollo di profilazione fenotipica descritto è scalabile in quanto utilizza piastre a 384 pozzetti, manipolazione automatica dei liquidi e microscopia ad alto rendimento. L'utilità del protocollo è esemplificata utilizzando neuroni mDA donatori sani e neuroni mDA portatori della mutazione G2019S legata al PD nel gene della chinasi ripetuta 2 ricca di leucina (LRRK2). Entrambe le linee cellulari sono state trattate con l'inibitore della chinasi LRRK2 PFE-360 e sono stati misurati i cambiamenti fenotipici. Inoltre, dimostriamo come i profili fenotipici multidimensionali possano essere analizzati utilizzando metodi di classificazione supervisionati basati sul clustering o sull'apprendimento automatico. Il protocollo descritto interesserà in particolare i ricercatori che lavorano sulla modellazione delle malattie neuronali o che studiano gli effetti dei composti chimici nei neuroni umani.
Una varietà di processi biologici cellulari sono disturbati nella malattia di Parkinson (PD). Ad esempio, la disfunzione mitocondriale, lo stress ossidativo, i difetti di degradazione delle proteine, l'interruzione del traffico vescicolare e la funzione endolisosomiale sono stati associati alla perdita di neuroni dopaminergici del mesencefalo (mDA), sono comunemente osservati nella PD1. Pertanto, la malattia di Parkinson sembra coinvolgere molteplici meccanismi patologici che possono interagire e peggiorarsi a vicenda. Un modo utile per studiare questa interazione meccanicistica è la creazione di un'impronta digitale fenotipica completa o di un....
1. Preparazione del terreno e delle piastre per la semina dei neuroni (Giorno 1)
La profilazione fenotipica nei neuroni mDA è un modo efficiente per quantificare molteplici aspetti della biologia cellulare e i loro cambiamenti durante la modulazione sperimentale. Per esemplificare questa metodologia, questo studio ha fatto uso di neuroni LRRK2 G2019S crioconservati e mDA di donatori sani. Questi neuroni sono stati differenziati per circa 37 giorni, sono marcatori neuronali post-mitotici ed espressi (TUBB3 e MAP2) e marcatori neuronali dopaminergici, tra cui la tirosina idrossilasi (TH) in combinazio.......
La profilazione fenotipica è una tecnica per misurare un gran numero di fenotipi nelle cellule applicando colorazioni fluorescenti, microscopia e analisi delle immagini3. I profili fenotipici possono essere ottenuti e confrontati tra linee cellulari o altre condizioni sperimentali per comprendere i cambiamenti complessi nella biologia cellulare che potrebbero passare inosservati quando si utilizza una singola lettura. Qui descriviamo l'applicazione del profilo fenotipico ai neuroni mDA umani deri.......
Tutti gli autori sono dipendenti di Ksilink.
Gli autori desiderano ringraziare tutti i colleghi di Ksilink per il loro prezioso aiuto e le discussioni che hanno portato alla progettazione del protocollo presentato.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Anti- chicken – Alexa 647 | Jackson ImmunoRearch | 703-605-155 | Immunofluorescence |
Anaconda | https://www.anaconda.com/download | ||
Anti-Map2 | Novus | NB300-213 | Immunofluorescence |
Anti-mouse - Alexa 488 | Thermo Fisher | A11001 | Immunofluorescence |
Anti-rabbit - Alexa 555 | Thermo Fisher | A21429 | Immunofluorescence |
Anti-Tyrosine Hydroxylase | Merck | T2928 | Immunofluorescence |
Anti-α-synuclein | Abcam | 138501 | Immunofluorescence |
Bravo Automated Liquid Handling Platform with 384ST head | Agilent | If no liquid handler is available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended. | |
Confocal microscope | Yokogawa | CV7000 | The use of an automated confocal fluorescence microscope is recommended to ensure image quality consistency. |
Countess Automated cell counter | Invitrogen | Cell counting before seeding. Can also be done using a manual counting chamber. | |
DPBS +/+ | Gibco | 14040-133 | Buffer for washing |
EL406 Washer Dispenser | BioTek (Agilent) | If no liquid handler is available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended. | |
Formaldehyde Solution (PFA 16 %) | Euromedex | EM-15710-S | Fixation before staining |
Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | Nuclear staining |
iCell Base Medium 1 | Fujifilm | M1010 | Base medium for neurons |
iCell DPN, Donor#01279, Phenotype AHN, lot#106339, 1M | Fujifilm | C1087 | Apparently healthy donor |
iCell DPN, Donor#11299, Phenotype LRRK2 G2019S, phenotype PD lot#106139 | Fujifilm | C1149 | Donor carrying LRRK2 G2019S mutation |
iCell Nervous System Supplement | Fujifilm | M1031 | Supplement for base medium |
iCell Neural Supplement B | Fujifilm | M1029 | Supplement for base medium |
Jupyter Python Notebook | In-house development | https://github.com/Ksilink/Notebooks/tree/main/Neuro/DopaNeuronProfiling | Notebook to perform phenotypic profile visualization and classification from raw data. |
Laminin | Biolamina | LN521 | Plate coating |
PFE-360 | MedChemExpress | HY-120085 | LRRK2 kinase inhibitor |
PhenoLink | In-house development | https://github.com/Ksilink/PhenoLink | Software for image analysis |
PhenoPlate 384w, PDL coated | Perkin Elmer | 6057500 | Pre-coated plate for cell culture and imaging. This plate allows imaging of all wells using all objectives of the Yokogawa CV7000 microscope. |
Storage plates Abgene 120 µL | Thermo Scientific | AB-0781 | Necessary for compound dispensing using the Vprep pipetting system. If not available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended. |
Triton | Sigma | T9284 | Permeabilization before lysis |
Trypan Blue | Sigma | T8154-20ML | Determination of living cells |
Vprep Pipetting System | Agilent | Medium change and compound dispensing. Alternatively, an electronic multichannel pipette can be used. |
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