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In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Questo protocollo descrive la coltura cellulare di neuroni dopaminergici del mesencefalo umano, seguita da colorazione immunologica e generazione di profili fenotipici neuronali da immagini microscopiche acquisite ad alto contenuto che consentono l'identificazione di variazioni fenotipiche dovute a modulazioni genetiche o chimiche.

Abstract

Il morbo di Parkinson (PD) è legato a una serie di processi biologici cellulari che causano la perdita di neuroni dopaminergici del mesencefalo (mDA). Molti attuali modelli cellulari di PD in vitro mancano di complessità e non tengono conto di fenotipi multipli. Il profilo fenotipico nei neuroni mDA derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC) può affrontare queste carenze misurando simultaneamente una serie di fenotipi neuronali in un tipo di cellula rilevante per la PD in parallelo. In questo articolo, descriviamo un protocollo per ottenere e analizzare i profili fenotipici da neuroni mDA umani disponibili in commercio. Un pannello di colorazione fluorescente specifico per i neuroni viene utilizzato per visualizzare i fenotipi correlati alla proteina nucleare, alla α-sinucleina, alla tirosina idrossilasi (TH) e alla proteina 2 associata ai microtubuli (MAP2). Il protocollo di profilazione fenotipica descritto è scalabile in quanto utilizza piastre a 384 pozzetti, manipolazione automatica dei liquidi e microscopia ad alto rendimento. L'utilità del protocollo è esemplificata utilizzando neuroni mDA donatori sani e neuroni mDA portatori della mutazione G2019S legata al PD nel gene della chinasi ripetuta 2 ricca di leucina (LRRK2). Entrambe le linee cellulari sono state trattate con l'inibitore della chinasi LRRK2 PFE-360 e sono stati misurati i cambiamenti fenotipici. Inoltre, dimostriamo come i profili fenotipici multidimensionali possano essere analizzati utilizzando metodi di classificazione supervisionati basati sul clustering o sull'apprendimento automatico. Il protocollo descritto interesserà in particolare i ricercatori che lavorano sulla modellazione delle malattie neuronali o che studiano gli effetti dei composti chimici nei neuroni umani.

Introduction

Una varietà di processi biologici cellulari sono disturbati nella malattia di Parkinson (PD). Ad esempio, la disfunzione mitocondriale, lo stress ossidativo, i difetti di degradazione delle proteine, l'interruzione del traffico vescicolare e la funzione endolisosomiale sono stati associati alla perdita di neuroni dopaminergici del mesencefalo (mDA), sono comunemente osservati nella PD1. Pertanto, la malattia di Parkinson sembra coinvolgere molteplici meccanismi patologici che possono interagire e peggiorarsi a vicenda. Un modo utile per studiare questa interazione meccanicistica è la creazione di un'impronta digitale fenotipica completa o di un....

Protocol

1. Preparazione del terreno e delle piastre per la semina dei neuroni (Giorno 1)

  1. Per preparare le piastre per la semina dei neuroni il giorno 1, riscaldare la laminina a temperatura ambiente (RT) appena prima dell'uso. Preparare la soluzione di Laminina diluendo la soluzione madre di Laminina (0,1 mg/mL) 1/10 in PBS+/+ freddo (con Ca 2+ e Mg2+).
    NOTA: Tutti i reagenti sono elencati nell'Indice dei materiali. Le composizioni delle soluzioni e dei tamponi.......

Representative Results

La profilazione fenotipica nei neuroni mDA è un modo efficiente per quantificare molteplici aspetti della biologia cellulare e i loro cambiamenti durante la modulazione sperimentale. Per esemplificare questa metodologia, questo studio ha fatto uso di neuroni LRRK2 G2019S crioconservati e mDA di donatori sani. Questi neuroni sono stati differenziati per circa 37 giorni, sono marcatori neuronali post-mitotici ed espressi (TUBB3 e MAP2) e marcatori neuronali dopaminergici, tra cui la tirosina idrossilasi (TH) in combinazio.......

Discussion

La profilazione fenotipica è una tecnica per misurare un gran numero di fenotipi nelle cellule applicando colorazioni fluorescenti, microscopia e analisi delle immagini3. I profili fenotipici possono essere ottenuti e confrontati tra linee cellulari o altre condizioni sperimentali per comprendere i cambiamenti complessi nella biologia cellulare che potrebbero passare inosservati quando si utilizza una singola lettura. Qui descriviamo l'applicazione del profilo fenotipico ai neuroni mDA umani deri.......

Acknowledgements

Gli autori desiderano ringraziare tutti i colleghi di Ksilink per il loro prezioso aiuto e le discussioni che hanno portato alla progettazione del protocollo presentato.

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Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti- chicken – Alexa 647Jackson ImmunoRearch703-605-155Immunofluorescence
Anacondahttps://www.anaconda.com/download
Anti-Map2NovusNB300-213Immunofluorescence
Anti-mouse - Alexa 488Thermo FisherA11001Immunofluorescence
Anti-rabbit - Alexa 555Thermo FisherA21429Immunofluorescence
Anti-Tyrosine HydroxylaseMerckT2928Immunofluorescence
Anti-α-synucleinAbcam138501Immunofluorescence
Bravo Automated Liquid Handling Platform with 384ST headAgilentIf no liquid handler is available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended.
Confocal microscope YokogawaCV7000The use of an automated confocal fluorescence microscope is recommended to ensure image quality consistency.
Countess Automated cell counterInvitrogenCell counting before seeding. Can also be done using a manual counting chamber.
DPBS +/+Gibco14040-133Buffer for washing
EL406 Washer Dispenser BioTek (Agilent) If no liquid handler is available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended.
Formaldehyde Solution (PFA 16 %)EuromedexEM-15710-SFixation before staining
Hoechst 33342InvitrogenH3570Nuclear staining
iCell Base Medium 1FujifilmM1010Base medium for neurons
iCell DPN, Donor#01279, Phenotype AHN, lot#106339, 1MFujifilmC1087Apparently healthy donor
iCell DPN, Donor#11299, Phenotype LRRK2 G2019S, phenotype PD lot#106139FujifilmC1149Donor carrying LRRK2 G2019S mutation 
iCell Nervous System SupplementFujifilmM1031Supplement for base medium
iCell Neural Supplement BFujifilmM1029Supplement for base medium
Jupyter Python NotebookIn-house developmenthttps://github.com/Ksilink/Notebooks/tree/main/Neuro/DopaNeuronProfilingNotebook to perform phenotypic profile visualization and classification from raw data.
LamininBiolaminaLN521Plate coating
PFE-360MedChemExpressHY-120085LRRK2 kinase inhibitor
PhenoLinkIn-house developmenthttps://github.com/Ksilink/PhenoLinkSoftware for image analysis
PhenoPlate 384w, PDL coatedPerkin Elmer6057500Pre-coated plate for cell culture and imaging. This plate allows imaging of all wells using all objectives of the Yokogawa CV7000 microscope.
Storage plates Abgene 120 µLThermo ScientificAB-0781Necessary for compound dispensing using the Vprep pipetting system. If not available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended.
TritonSigmaT9284Permeabilization before lysis
Trypan BlueSigmaT8154-20MLDetermination of living cells
Vprep Pipetting System AgilentMedium change and compound dispensing. Alternatively, an electronic multichannel pipette can be used.

References

  1. Panicker, N., Ge, P., Dawson, V. L., Dawson, T. M. The cell biology of Parkinson's disease. The Journal of Cell Biology. 220 (4), 202012095 (2021).
  2. Caicedo, J. C., et al. Data-analysis strategies for image-based cell profiling.

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