저자는 제시된 프로토콜의 설계로 이어지는 귀중한 도움과 토론에 대해 Ksilink의 모든 동료에게 감사의 뜻을 전합니다.

1. 뉴런 파종을 위한 배지 및 플레이트 준비(1일차)
<ol><li>Day-1에 뉴런 파종을 위해 플레이트를 준비하려면 사용 직전에 라미닌을 실온(RT)으로 데우십시오. 라미닌 원액(0.1mg/mL)을 차가운 PBS+/+(Ca 2+ 및 Mg2+ 포함)에 1/10로 희석하여 라미닌 용액을 준비합니다. 알림: 모든 시약은 재료 표에 나열되어 있습니다. 용액 및 완충액의 조성은 표 1-4에 ?...

표현형 프로파일링을 위한 인간 중뇌 도파민 뉴런 배양

<ol>
	<li>Panicker, N., Ge, P., Dawson, V. L., Dawson, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+Parkinson's+disease.">The cell biology of Parkinson's disease.</a> The Journal of Cell Biology. 220 (4), 202012095 (2021).</li><li>Caicedo, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data-analysis+strategies+for+image-based+cell+profiling.">Data-analysis strategies for image-based cell profiling.</a> Nature Methods. 14 (9), 849-863 (2017).</li><li>Chandrasekaran, S. N., Ceulemans, H., Boyd, J. D., Carpenter, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+profiling+for+drug+discovery:+due+for+a+machine-learning+upgrade.">Image-based profiling for drug discovery: due for a machine-learning upgrade.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 20 (2), 145-159 (2021).</li><li>Bray, M. -. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Painting,+a+high-content+image-based+assay+for+morphological+profiling+using+multiplexed+fluorescent+dyes.">Cell Painting, a high-content image-based assay for morphological profiling using multiplexed fluorescent dyes.</a> Nature Protocols. 11 (9), 1757-1774 (2016).</li><li>Schiff, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+deep+learning+and+unbiased+automated+high-content+screening+to+identify+complex+disease+signatures+in+human+fibroblasts.">Integrating deep learning and unbiased automated high-content screening to identify complex disease signatures in human fibroblasts.</a> Nature Communications. 13 (1), 1590 (2022).</li><li>Ziegler, S., Sievers, S., Waldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+profiling+of+small+molecules.">Morphological profiling of small molecules.</a> Cell Chemical Biology. 28 (3), 300-319 (2021).</li><li>Cobb, M. M., Ravisankar, A., Skibinski, G., Finkbeiner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iPS+cells+in+the+study+of+PD+molecular+pathogenesis.">iPS cells in the study of PD molecular pathogenesis.</a> Cell and Tissue Research. 373 (1), 61-77 (2018).</li><li>Elitt, M. S., Barbar, L., Tesar, P. 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A., Goodman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler+4:+improvements+in+speed,+utility+and+usability.">CellProfiler 4: improvements in speed, utility and usability.</a> BMC Bioinformatics. 22 (1), 433 (2021).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Sofroniew, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> napari: a multi-dimensional image viewer for Python. , (2022).</li><li>Berthold, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KNIME:+The+Konstanz+Information+Miner.">KNIME: The Konstanz Information Miner.</a> Data Analysis, Machine Learning and Applications. , 319-326 (2008).</li><li>Fathi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverging+Parkinson's+Disease+Pathology+between+patient-derived+GBAN370S,+LRRK2G2019S+and+engineered+SNCAA53T+iPSC-derived+Dopaminergic+Neurons.">Diverging Parkinson's Disease Pathology between patient-derived GBAN370S, LRRK2G2019S and engineered SNCAA53T iPSC-derived Dopaminergic Neurons.</a> bioRxiv. , (2023).</li><li>Wang, Y., Huang, H., Rudin, C., Shaposhnik, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+How+Dimension+Reduction+Tools+Work:+An+Empirical+Approach+to+Deciphering+t-SNE,+UMAP,+TriMap,+and+PaCMAP+for+Data+Visualization.">Understanding How Dimension Reduction Tools Work: An Empirical Approach to Deciphering t-SNE, UMAP, TriMap, and PaCMAP for Data Visualization.</a> Journal of Machine Learning Research. 22 (201), 1-73 (2021).</li><li>Ke, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LightGBM:+A+highly+efficient+gradient+boosting+decision+tree.">LightGBM: A highly efficient gradient boosting decision tree.</a> Advances in Neural Information Processing Systems. 30, (2017).</li><li>Avazzadeh, S., Baena, J. M., Keighron, C., Feller-Sanchez, Y., Quinlan, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+Parkinson's+Disease:+iPSCs+towards+Better+Understanding+of+Human+Pathology.">Modelling Parkinson's Disease: iPSCs towards Better Understanding of Human Pathology.</a> Brain Sciences. 11 (3), 373 (2021).</li><li>S&#225;nchez-Dan&#233;s, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease-specific+phenotypes+in+dopamine+neurons+from+human+iPS-based+models+of+genetic+and+sporadic+Parkinson's+disease.">Disease-specific phenotypes in dopamine neurons from human iPS-based models of genetic and sporadic Parkinson's disease.</a> EMBO Molecular Medicine. 4 (5), 380-395 (2012).</li><li>Oosterveen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cell+derived+dopaminergic+subpopulations+model+the+selective+neuron+degeneration+in+Parkinson's+disease.">Pluripotent stem cell derived dopaminergic subpopulations model the selective neuron degeneration in Parkinson's disease.</a> Stem Cell Reports. 16 (11), 2718-2735 (2021).</li><li>Hughes, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+high-content+cell+painting+identifies+copper+ionophores+as+selective+modulators+of+esophageal+cancer+phenotypes.">Multiparametric high-content cell painting identifies copper ionophores as selective modulators of esophageal cancer phenotypes.</a> ACS Chemical Biology. 17 (7), 1876-1889 (2022).</li><li>Akbarzadeh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+profiling+by+means+of+the+Cell+Painting+assay+enables+identification+of+tubulin-targeting+compounds.">Morphological profiling by means of the Cell Painting assay enables identification of tubulin-targeting compounds.</a> Cell Chemical Biology. 29 (6), 1053-1064 (2022).</li><li>Schiff, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+deep+learning+and+unbiased+automated+high-content+screening+to+identify+complex+disease+signatures+in+human+fibroblasts.">Integrating deep learning and unbiased automated high-content screening to identify complex disease signatures in human fibroblasts.</a> Nature Communications. 13 (1), 1590 (2022).</li><li>Way, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+and+gene+expression+profiling+provide+complementary+information+for+mapping+cell+state.">Morphology and gene expression profiling provide complementary information for mapping cell state.</a> Cell Systems. 13 (11), 911-923 (2022).</li><li>Feng, Y., Mitchison, T. J., Bender, A., Young, D. W., Tallarico, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-parameter+phenotypic+profiling:+using+cellular+effects+to+characterize+small-molecule+compounds.">Multi-parameter phenotypic profiling: using cellular effects to characterize small-molecule compounds.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 8 (7), 567-578 (2009).</li><li>Antonov, S. A., Novosadova, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+state-of-the-art+and+unresolved+problems+in+using+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+dopamine+neurons+for+parkinson's+disease+drug+development.">Current state-of-the-art and unresolved problems in using human induced pluripotent stem cell-derived dopamine neurons for parkinson's disease drug development.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (7), 3381 (2021).</li><li>Miller, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC-based+modeling+of+late-onset+disease+via+progerin-induced+aging.">Human iPSC-based modeling of late-onset disease via progerin-induced aging.</a> Cell Stem Cell. 13 (6), 691-705 (2013).</li><li>Bezard, E., Gross, C. E., Brotchie, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presymptomatic+compensation+in+Parkinson's+disease+is+not+dopamine-mediated.">Presymptomatic compensation in Parkinson's disease is not dopamine-mediated.</a> Trends in Neurosciences. 26 (4), 215-221 (2003).</li><li>Wu, Y., Le, W., Jankovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+Biomarkers+of+parkinson+disease.">Preclinical Biomarkers of parkinson disease.</a> Archives of Neurology. 68 (1), 22-30 (2011).</li><li>Verstraelen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+quantification+of+synapses+in+primary+neuronal+culture.">Systematic quantification of synapses in primary neuronal culture.</a> iScience. 23 (9), 101542 (2020).</li><li>Liu-Yesucevitz, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALS-Linked+mutations+enlarge+TDP-43-enriched+neuronal+RNA+granules+in+the+dendritic+arbor.">ALS-Linked mutations enlarge TDP-43-enriched neuronal RNA granules in the dendritic arbor.</a> The Journal of Neuroscience. 34 (12), 4167-4174 (2014).</li></ol>

표현형 프로파일링(Phenotypic profiling)은 형광 염색, 현미경 검사, 이미지 분석 등을 적용하여 세포에서 많은 수의 표현형을 측정하는 기술이다3. 표현형 프로파일을 얻고 세포주 또는 기타 실험 조건에서 비교하여 단일 판독값을 사용할 때 눈에 띄지 않을 수 있는 세포 생물학의 복잡한 변화를 이해할 수 있습니다. 여기서는 PD 세포 생물학17,18,19<sup class="xr...

파킨슨병(PD)에서는 다양한 세포 생물학적 과정이 방해를 받습니다. 예를 들어, 미토콘드리아 기능 장애, 산화 스트레스, 단백질 분해 결함, 소포 이동 및 엔도리소좀 기능 장애는 중뇌 도파민(mDA) 뉴런 손실과 관련이 있으며, PD1에서 일반적으로 관찰됩니다. 따라서 파킨슨병은 서로 상호작용하고 악화시킬 수 있는 여러 질병 기전을 포함하는 것으로 보입니다. 이 기계론적 상호 작용을 조사하는 한 가지 유용한 방법은 중뇌 도파민(mDA) 뉴런의 포괄적인 표현형 지문 또는 프로필을 생성하는 것입니다.
표현형 프로파일링은 측정 가능한 특성의 모음을 기반으로 샘플의 프로필을 생성하는 것과 관련된 접근 방식이며, 둘째, 이 프로필 2,3을 기반으로 샘플에 대한 예측을 수행하는 것을 포함합니다. 프로파일링의 목표는 다양한 특징을 포착하는 것이며, 그 중 일부는 이전에 질병이나 치료와 관련이 없었을 수 있다3. 결과적으로 프로파일링을 통해 예상치 못한 생물학적 과정을 밝힐 수 있습니다. 표현형 프로파일링은 일반적으로 형광 염색된 세포에 의존하며, 표현형 프로파일을 생성하기 위해 셀 페인팅(Cell Painting)과 같은 표준화된 분석법이 개발되었습니다4. 최근에, 표현형 프로파일링은 예를 들어, 소분자의 특성 분석 또는 환자 유래 섬유아세포만을 기반으로 하는 PD 아형의 정확한 예측에 적용되고 있다 5,6. 이러한 발전에도 불구하고 표현형 프로파일링은 LRRK2 G2019S와 같은 PD 연결 돌연변이를 발현하는 인간 유도만능줄기세포(iPSC) 유래 mDA 뉴런과 같은 유사분열 후 분화 세포에 거의 적용되지 않았습니다. iPSC 유래 모델의 중요한 과제로는 분화 배치 또는 유전자형에 걸쳐 미묘하거나 가변적인 병리학적 특징이 존재한다는 점과 분리된 PD 표현형이 질병의 전체 복잡성을 포착하지 못한다는 사실이 있습니다. 또한, iPSC 신경 세포 모델은 생리학적으로 관련이 있지만, 기술적 복잡성에 대한 우려로 인해 PD 약물 발견 프로세스에서는 거의 사용되지 않습니다 7,8.
우리는 이전에 유전적 및 화학적 화합물 유도 표현형 변화에 민감한 인간 mDA 뉴런에서 여러 PD 관련 병태생리학적 표현형을 측정하기 위한 강력한 방법론을 개발했습니다9. 이 기사에서는 mDA 뉴런에서 표현형 프로파일을 생성하기 위해 이 방법론을 더욱 최적화된 버전으로 만드는 방법에 대해 자세히 설명합니다(그림 1). 이 프로토콜은 고품질 mDA 뉴런의 사용 및 기술적 재현성과 같은 앞서 설명한 표현형 프로파일링 접근 방식에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 처음으로, 이 프로토콜은 확장성이 뛰어난 방식으로 화학적 섭동 후 생리학적으로 관련된 유사분열 후 mDA 뉴런에서 표현형 프로파일링을 가능하게 합니다. 완전히 분화되고 동결 보존된 mDA 뉴런은 상용화되어 배치 간 분화 변동성을 크게 줄여줍니다. 둘째, 잘 정의된 실험 설계(예: 배양 기간 또는 에지 웰 방지), 자동화된 액체 처리 및 자동화된 현미경을 사용하여 기술적 변동성을 더욱 줄일 수 있습니다. 또한 비지도 클러스터링 또는 지도 분류 접근 방식을 사용한 표현형 프로파일 분석의 초기 단계가 여기에 요약되어 표현형 프로파일링 데이터를 분석할 수 있는 방법을 나타냅니다. 이 프로토콜은 유전적 또는 화학적 섭동에 의해 유도된 mDA 뉴런의 표현형 변화에 관심이 있는 연구자, 특히 스크리닝 캠페인 중 또는 독성 효과를 결정하기 위해 더 적은 수의 화합물의 효과를 연구해야 하는 경우와 같이 확장성이 뛰어난 연구 설정이 필요한 경우에 사용됩니다. 요약하면, 인간 뉴런의 표현형 프로파일링의 적용은 복잡한 질병 관련 표현형을 연구하고 약물 후보의 세포 효과를 특성화하는 데 유용한 기술일 것으로 예상됩니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65570/65570fig01.jpg"> 그림 1: 인간 iPSC 유래 mDA 뉴런에서 이미지 기반 표현형 프로파일을 생성하기 위한 실험 프로토콜의 개략도. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65570/65570fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti- chicken &#8211; Alexa 647</td>
			<td>Jackson ImmunoRearch</td>
			<td>703-605-155</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaconda</td>
			<td></td>
			<td>https://www.anaconda.com/download</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Map2</td>
			<td>Novus</td>
			<td>NB300-213</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse - Alexa 488</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A11001</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit - Alexa 555</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A21429</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tyrosine Hydroxylase</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T2928</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-&#945;-synuclein</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>138501</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bravo Automated Liquid Handling Platform with 384ST head</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>If no liquid handler is available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope&#160;</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td>CV7000</td>
			<td>The use of an automated confocal fluorescence microscope is recommended to ensure image quality consistency.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Automated cell counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>Cell counting before seeding. Can also be done using a manual counting chamber.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS +/+</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14040-133</td>
			<td>Buffer for washing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EL406 Washer Dispenser&#160;</td>
			<td>BioTek (Agilent)&#160;</td>
			<td></td>
			<td>If no liquid handler is available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde Solution (PFA 16 %)</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>EM-15710-S</td>
			<td>Fixation before staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td>Nuclear staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell Base Medium 1</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td>M1010</td>
			<td>Base medium for neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell DPN, Donor#01279, Phenotype AHN, lot#106339, 1M</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td>C1087</td>
			<td>Apparently healthy donor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell DPN, Donor#11299, Phenotype LRRK2 G2019S, phenotype PD lot#106139</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td>C1149</td>
			<td>Donor carrying LRRK2 G2019S mutation&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell Nervous System Supplement</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td>M1031</td>
			<td>Supplement for base medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iCell Neural Supplement B</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td>M1029</td>
			<td>Supplement for base medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jupyter Python Notebook</td>
			<td>In-house development</td>
			<td>https://github.com/Ksilink/Notebooks/tree/main/Neuro/DopaNeuronProfiling</td>
			<td>Notebook to perform phenotypic profile visualization and classification from raw data.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Biolamina</td>
			<td>LN521</td>
			<td>Plate coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFE-360</td>
			<td>MedChemExpress</td>
			<td>HY-120085</td>
			<td>LRRK2 kinase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhenoLink</td>
			<td>In-house development</td>
			<td>https://github.com/Ksilink/PhenoLink</td>
			<td>Software for image analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhenoPlate 384w, PDL coated</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6057500</td>
			<td>Pre-coated plate for cell culture and imaging. This plate allows imaging of all wells using all objectives of the Yokogawa CV7000 microscope.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storage plates Abgene 120 &#181;L</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB-0781</td>
			<td>Necessary for compound dispensing using the Vprep pipetting system. If not available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td>Permeabilization before lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154-20ML</td>
			<td>Determination of living cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vprep Pipetting System&#160;</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Medium change and compound dispensing. Alternatively, an electronic multichannel pipette can be used.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

phenotypic profiling of human stem cell-derived midbrain dopaminergic neurons

파킨슨병(PD)은 중뇌 도파민(mDA) 뉴런 손실을 유발하는 다양한 세포 생물학적 과정과 관련이 있습니다. 현재의 많은 in vitro PD 세포 모델은 복잡성이 부족하고 여러 표현형을 고려하지 않습니다. 인간 유도 만능 줄기 세포(iPSC) 유래 mDA 뉴런의 표현형 프로파일링은 PD 관련 세포 유형에서 다양한 뉴런 표현형을 동시에 측정하여 이러한 단점을 해결할 수 있습니다. 여기서는 상업적으로 이용 가능한 인간 mDA 뉴런에서 표현형 프로파일을 얻고 분석하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 뉴런 특이적 형광 염색 패널은 핵, α-시누클레인, 티로신 하이드록실라제(TH) 및 미세소관 관련 단백질 2(MAP2) 관련 표현형을 시각화하는 데 사용됩니다. 설명된 표현형 프로파일링 프로토콜은 384웰 플레이트, 자동 액체 처리 및 고처리량 현미경을 사용하기 때문에 확장 가능합니다. 프로토콜의 유용성은 건강한 기증자 mDA 뉴런과 류신이 풍부한 반복 키나아제 2(LRRK2) 유전자에서 PD 결합 G2019S 돌연변이를 운반하는 mDA 뉴런을 사용하여 예시됩니다. 두 세포주 모두 LRRK2 키나아제 억제제 PFE-360으로 처리하고 표현형 변화를 측정했습니다. 또한 클러스터링 또는 기계 학습 기반 지도 분류 방법을 사용하여 다차원 표현형 프로파일을 분석하는 방법을 보여줍니다. 설명된 프로토콜은 신경 질환 모델링을 연구하거나 인간 신경 세포의 화합물 효과를 연구하는 연구자들에게 특히 흥미로울 것입니다.

A variety of cell biological processes are disturbed in Parkinson&#39;s disease (PD). For example, mitochondrial dysfunction, oxidative stress, protein degradation defects, disruption of vesicular trafficking and endolysosomal function have been associated with midbrain dopaminergic (mDA) neuron loss, are commonly observed in PD1. Therefore, PD appears to involve multiple disease mechanisms that can interact with and worsen each other. One useful way to investigate this mechanistic interplay is the creation of a comprehensive phenotypic fingerprint or profile of midbrain dopaminergic (mDA) neurons.
Phenotypic profiling is an approach that involves creating a profile of a sample based on a collection of measurable characteristics, and second, it involves making predictions about a sample based on this profile2,3. The goal of profiling is to capture a diverse range of features, some of which may not have been previously associated with a disease or treatment3. As a result, profiling can reveal unexpected biological processes. Phenotypic profiling typically relies on fluorescently stained cells, and standardized assays, such as Cell Painting, have been developed to create phenotypic profiles4. Recently, phenotypic profiling has, for example, been applied for the characterization of small molecules or the accurate prediction of PD-subtypes solely based on patient-derived fibroblasts5,6. Despite these advances, phenotypic profiling has rarely been applied to post-mitotic differentiated cells, such as human induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived mDA neurons that express PD-linked mutations such as LRRK2 G2019S. Significant challenges of iPSC-derived models include the presence of subtle or variable pathological features across differentiation batches or genotypes, and the fact that isolated PD phenotypes do not capture the full complexity of the disease. Furthermore, while iPSC neuronal models are physiologically relevant, they are rarely used in PD drug discovery processes due to concerns about technical complexity7,8.
We previously developed a robust methodology to measure multiple PD-related pathophysiological phenotypes in human mDA neurons that are both sensitive to genetic and chemical compound-induced phenotypic changes9. This article describes in detail a further optimized version of this methodology to create phenotypic profiles from mDA neurons (Figure 1). This protocol has several advantages over the previously described phenotypic profiling approaches, such as the use of high-quality mDA neurons and technical reproducibility. For the first time, this protocol enables phenotypic profiling in physiologically relevant post-mitotic mDA neurons after chemical perturbations in a highly scalable fashion. Fully differentiated and cryopreserved mDA neurons are commercially available, significantly decreasing batch-to-batch differentiation variability. Secondly, technical variability can be further reduced by using a well-defined experimental design (i.e., culture duration or avoiding edge wells), automated liquid handling and automated microscopy. Additionally, the initial steps of phenotypic profile analysis using unsupervised clustering or supervised classification approaches are outlined here, indicating how phenotypic profiling data can be analyzed. This protocol will be of use for researchers interested in phenotypic changes of mDA neurons induced by genetic or chemical perturbations, specifically when a highly scalable study setup is required, for example, during screening campaigns or when the effects of a smaller number of compounds are to be studied, for example, to determine toxic effects. In summary, it is anticipated that the application of phenotypic profiling of human neurons is a valuable technique to study complex disease-related phenotypes and characterize the cellular effects of drug candidates.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65570/65570fig01.jpg" /> 
Figure 1: Schematic depiction of the experimental protocol to generate image-based phenotypic profiles from human iPSC-derived mDA neurons. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65570/65570fig01large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

저자 스포트라이트: Generating Neuronal Phenotypic Profiles - A Protocol to Culture and Image Human Midbrain Dopaminergic Neurons (저자 스포트라이트: 신경 세포 표현형 프로파일 생성 - 인간 중뇌 도파민 뉴런을 배양하고 이미지화하는 프로토콜) 

인간 줄기세포 유래 중뇌 도파민 뉴런의 표현형 프로파일링

We construct phenotypic profiles of differentiated human cells such as neurons. Our goal is to better understand the overall effects of chemical compound treatments on the cells. Phenotypic profiles can suggest less biased entry points for further mechanistic studies.The quality of protocols for differentiating human dopaminergic neurons has significantly improved, enabling the production of large batches of homogeneous neurons. Additionally, there is a rise in the use of lab automation for handling differentiated cells'reproducibility over extended periods, and of course, the exploitation of imaging-based data has become faster and more detailed. A big challenge is to ensure that phenotypic profiles are both quantifiable and reproducible.To achieve this, it is crucial to produce homogeneous neuron batches and identify an automation-suited protocol. However, with an automated protocols, there is always a trade-off between technical feasibility and physiological relevance. Here, we found a good trade-off.We developed a ready-to-use solution to thoroughly characterize human dopaminergic neurons using an imaging approach. The automated protocol, along with the image and data analysis workflow, will equip more scientists to create neuronal phenotypic profiles. We would like to better understand how phenotypic profiles differ between monogenetic and idiopathic forms of Parkinson's disease.We would also like to explore the changes in phenotypic aspects when dopaminergic neurons interact with other brain cell types such as microglia, for example.

mDA 뉴런의 표현형 프로파일링은 세포 생물학의 여러 측면과 실험 조절 중 변화를 정량화하는 효율적인 방법입니다. 이 방법론을 예시하기 위해 이 연구에서는 냉동 보존된 LRRK2 G2019S와 건강한 기증자 mDA 뉴런을 사용했습니다. 이 뉴런은 약 37일 동안 분화되었고, 유사분열 후 발현 뉴런 마커(TUBB3 및 MAP2)와 FOXA2와 결합된 티로신 하이드록실라제(TH)를 포함한 도파민성 뉴런 마커인 반면, 신경교세포 ?...

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이 프로토콜은 인간 중뇌 도파민 뉴런의 세포 배양에 이어 면역학적 염색 및 획득된 현미경 high-content 이미지에서 신경 세포 표현형 프로파일 생성을 설명하여 유전적 또는 화학적 조절로 인한 표현형 변이를 식별할 수 있습니다.

Parkinson&#39;s disease (PD) is linked to a range of cell biological processes that cause midbrain dopaminergic (mDA) neuron loss. Many current in vitro ...

우리는 뉴런과 같은 분화된 인간 세포의 표현형 프로파일을 구성합니다. 우리의 목표는 세포에 대한 화합물 처리의 전반적인 효과를 더 잘 이해하는 것입니다. 표현형 프로파일은 추가 기계론적 연구를 위한 덜 편향된 진입점을 제안할 수 있습니다.인간 도파민 뉴런을 분화하기 위한 프로토콜의 품질이 크게 향상되어 균질한 뉴런의 대량 생산이 가능해졌습니다. 또한 장기간에 걸쳐 분화된 세포의 재현성을 처리하기 위해 실험실 자동화의 사용이 증가하고 있으며, 물론 이미징 기반 데이터의 활용이 더 빠르고 상세해졌습니다. 가장 큰 과제는 표현형 프로파일이 정량화되고 재현 가능한지 확인하는 것입니다.이를 위해서는 동종 뉴런 배치를 생성하고 자동화에 적합한 프로토콜을 식별하는 것이 중요합니다. 그러나 자동화된 프로토콜을 사용하면 기술적 타당성과 생리학적 관련성 사이에 항상 절충안이 있습니다. 여기서 우리는 좋은 절충안을 찾았습니다.우리는 이미징 접근 방식을 사용하여 인간의 도파민 신경 세포를 철저히 특성화하기 위해 즉시 사용할 수 있는 솔루션을 개발했습니다. 자동화된 프로토콜은 이미지 및 데이터 분석 워크플로우와 함께 더 많은 과학자들이 신경 표현형 프로파일을 생성할 수 있도록 지원합니다. 우리는 파킨슨병의 단일유전적 형태와 특발성 형태 간에 표현형 프로파일이 어떻게 다른지 더 잘 이해하고자 합니다.우리는 또한 도파민 뉴런이 예를 들어 미세아교세포와 같은 다른 뇌세포 유형과 상호 작용할 때 표현형 측면의 변화를 탐구하고자 합니다.

인간 줄기세포 유래 중뇌 도파민 뉴런의 표현형 프로파일링

Abstract