Transgenexpressie in gekweekte cellen met behulp van ongezuiverde recombinante adeno-geassocieerde virale vectoren

Recombinante adeno-geassocieerde virale vectoren (rAAV) kunnen krachtige en duurzame transgenexpressie bereiken zonder integratie in een breed scala aan weefseltypes, waardoor ze een populaire keuze zijn voor genafgifte in diermodellen en in klinische omgevingen. Naast therapeutische toepassingen zijn rAAV's een nuttig laboratoriuminstrument voor het afleveren van transgenen die zijn afgestemd op de experimentele behoeften en wetenschappelijke doelen van de onderzoeker in gekweekte cellen. Enkele voorbeelden zijn exogene reportergenen, overexpressiecassettes, RNA-interferentie en op CRISPR gebaseerde tools, waaronder die voor genoombrede screenings. rAAV-transducties zijn minder schadelijk voor cellen dan elektroporatie of chemische transfectie en vereisen geen speciale apparatuur of dure reagentia om te produceren. Ruwe lysaten of geconditioneerde media die rAAV's bevatten, kunnen rechtstreeks aan gekweekte cellen worden toegevoegd zonder verdere zuivering om veel celtypen te transduceren - een ondergewaardeerde eigenschap van rAAV's. Hier bieden we protocollen voor het klonen van transgencassettes en demonstreren we hoe ruwe rAAV-preparaten kunnen worden geproduceerd en toegepast op gekweekte cellen. Als proof of principle demonstreren we de transductie van drie celtypes die nog niet gerapporteerd zijn in rAAV-toepassingen: placentacellen, myoblasten en organoïden van de dunne darm. We bespreken geschikte toepassingen voor ruwe rAAV-preparaten, de beperkingen van rAAV's voor genafgifte en overwegingen voor capsidekeuze. Dit protocol schetst een eenvoudige, goedkope en effectieve methode voor onderzoekers om productieve DNA-afgifte in celkweek te bereiken met behulp van rAAV zonder de noodzaak van moeizame titratie- en zuiveringsstappen.