Transgenexpression in kultivierten Zellen mit ungereinigten rekombinanten Adeno-assoziierten viralen Vektoren

Rekombinante Adeno-assoziierte virale Vektoren (rAAV) können eine starke und dauerhafte Transgenexpression erreichen, ohne sie in ein breites Spektrum von Gewebetypen zu integrieren, was sie zu einer beliebten Wahl für die Genverabreichung in Tiermodellen und in klinischen Umgebungen macht. Neben therapeutischen Anwendungen sind rAAVs ein nützliches Laborwerkzeug für die Verabreichung von Transgenen, die auf die experimentellen Bedürfnisse und wissenschaftlichen Ziele des Forschers in kultivierten Zellen zugeschnitten sind. Einige Beispiele sind exogene Reportergene, Überexpressionskassetten, RNA-Interferenz und CRISPR-basierte Werkzeuge, einschließlich solcher für genomweite Screenings. rAAV-Transduktionen sind weniger schädlich für Zellen als Elektroporation oder chemische Transfektion und erfordern keine spezielle Ausrüstung oder teure Reagenzien für die Herstellung. Rohe Lysate oder konditionierte Medien, die rAAVs enthalten, können ohne weitere Aufreinigung direkt zu kultivierten Zellen hinzugefügt werden, um viele Zelltypen zu transduzieren – ein unterschätztes Merkmal von rAAVs. Hier stellen wir Protokolle für die grundlegende Klonierung von Transgenkassetten zur Verfügung und zeigen, wie rohe rAAV-Präparate hergestellt und auf kultivierte Zellen angewendet werden. Als Proof of Principle demonstrieren wir die Transduktion von drei Zelltypen, die bisher noch nicht in rAAV-Anwendungen beschrieben wurden: Plazentazellen, Myoblasten und Dünndarmorganoide. Wir diskutieren geeignete Anwendungen für rohe rAAV-Präparate, die Grenzen von rAAVs für die Genübertragung und Überlegungen zur Kapsidwahl. Dieses Protokoll beschreibt eine einfache, kostengünstige und effektive Methode für Forscher, um eine produktive DNA-Verabreichung in Zellkulturen mit rAAV zu erreichen, ohne dass mühsame Titrations- und Reinigungsschritte erforderlich sind.