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Biology

अशुद्ध पुनः संयोजक एडेनो-संबद्ध वायरल वैक्टर का उपयोग करके सुसंस्कृत कोशिकाओं में ट्रांसजीन अभिव्यक्ति

Published: October 20th, 2023

DOI:

10.3791/65572

1Department of Molecular and Cell Biology, University of California, Berkeley, 2Biophysics Graduate Group, University of California, Berkeley

Abstract

पुनः संयोजक एडेनो से जुड़े वायरल वैक्टर (आरएएवी) ऊतक प्रकारों की एक विस्तृत श्रृंखला में एकीकरण के बिना शक्तिशाली और टिकाऊ ट्रांसजेन अभिव्यक्ति प्राप्त कर सकते हैं, जिससे उन्हें पशु मॉडल और नैदानिक सेटिंग्स में जीन वितरण के लिए एक लोकप्रिय विकल्प बना दिया जाता है। चिकित्सीय अनुप्रयोगों के अलावा, आरएएवी सुसंस्कृत कोशिकाओं में शोधकर्ता की प्रयोगात्मक आवश्यकताओं और वैज्ञानिक लक्ष्यों के अनुरूप ट्रांसजेन देने के लिए एक उपयोगी प्रयोगशाला उपकरण हैं। कुछ उदाहरणों में बहिर्जात रिपोर्टर जीन, ओवरएक्प्रेशन कैसेट, आरएनए हस्तक्षेप और सीआरआईएसपीआर-आधारित उपकरण शामिल हैं, जिनमें जीनोम-वाइड स्क्रीन शामिल हैं। आरएएवी ट्रांसडक्शन इलेक्ट्रोपोरेशन या रासायनिक अभिकर्मक की तुलना में कोशिकाओं के लिए कम हानिकारक होते हैं और उत्पादन के लिए किसी विशेष उपकरण या महंगे अभिकर्मकों की आवश्यकता नहीं होती है। कच्चे लाइसेट या आरएएवी युक्त वातानुकूलित मीडिया को कई सेल प्रकारों को ट्रांसड्यूस करने के लिए आगे शुद्धिकरण के बिना सीधे सुसंस्कृत कोशिकाओं में जोड़ा जा सकता है- आरएएवी की एक कम सराहना की गई विशेषता। यहां, हम बुनियादी ट्रांसजेन कैसेट क्लोनिंग के लिए प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं और प्रदर्शित करते हैं कि सुसंस्कृत कोशिकाओं के लिए क्रूड आरएएवी तैयारी का उत्पादन और लागू कैसे किया जाए। सिद्धांत के प्रमाण के रूप में, हम तीन सेल प्रकारों के पारगमन का प्रदर्शन करते हैं जो अभी तक आरएएवी अनुप्रयोगों में रिपोर्ट नहीं किए गए हैं: प्लेसेंटल कोशिकाएं, मायोब्लास्ट्स और छोटे आंतों के ऑर्गेनोइड्स। हम कच्चे आरएएवी तैयारी के लिए उपयुक्त उपयोग, जीन वितरण के लिए आरएएवी की सीमाओं और कैप्सिड पसंद के लिए विचारों पर चर्चा करते हैं। यह प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं के लिए श्रमसाध्य अनुमापन और शुद्धिकरण चरणों की आवश्यकता के बिना आरएएवी का उपयोग करके सेल संस्कृति में उत्पादक डीएनए वितरण प्राप्त करने के लिए एक सरल, कम लागत वाली और प्रभावी विधि को रेखांकित करता है।

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