Espressione di transgeni in cellule in coltura utilizzando vettori virali adeno-associati ricombinanti non purificati

I vettori virali adeno-associati ricombinanti (rAAV) possono raggiungere un'espressione transgenica potente e duratura senza integrazione in un'ampia gamma di tipi di tessuto, rendendoli una scelta popolare per la somministrazione genica in modelli animali e in contesti clinici. Oltre alle applicazioni terapeutiche, gli rAAV sono un utile strumento di laboratorio per la somministrazione di transgeni su misura per le esigenze sperimentali e gli obiettivi scientifici del ricercatore nelle cellule in coltura. Alcuni esempi includono geni reporter esogeni, cassette di sovraespressione, interferenza dell'RNA e strumenti basati su CRISPR, compresi quelli per gli screening dell'intero genoma. Le trasduzioni di rAAV sono meno dannose per le cellule rispetto all'elettroporazione o alla trasfezione chimica e non richiedono attrezzature speciali o reagenti costosi per essere prodotte. I lisati grezzi o i terreni condizionati contenenti rAAV possono essere aggiunti direttamente alle cellule in coltura senza ulteriore purificazione per trasdurre molti tipi di cellule, una caratteristica sottovalutata degli rAAV. Qui, forniamo protocolli per il clonaggio di cassette transgeniche di base e dimostriamo come produrre e applicare preparazioni di rAAV grezze alle cellule in coltura. Come prova di principio, dimostriamo la trasduzione di tre tipi di cellule che non sono ancora state riportate nelle applicazioni rAAV: cellule placentari, mioblasti e organoidi dell'intestino tenue. Discutiamo gli usi appropriati per le preparazioni di rAAV grezze, i limiti dei rAAV per la consegna genica e le considerazioni per la scelta del capside. Questo protocollo delinea un metodo semplice, economico ed efficace per i ricercatori per ottenere la consegna produttiva del DNA in coltura cellulare utilizzando rAAV senza la necessità di laboriose fasi di titolazione e purificazione.