Transgen ekspresjon i dyrkede celler ved bruk av urensede rekombinante adenoassosierte virale vektorer

Rekombinante adenoassosierte virale vektorer (rAAV) kan oppnå potent og holdbart transgenuttrykk uten integrering i et bredt spekter av vevstyper, noe som gjør dem til et populært valg for genlevering i dyremodeller og i kliniske omgivelser. I tillegg til terapeutiske anvendelser er rAAVs et nyttig laboratorieverktøy for å levere transgener skreddersydd for forskerens eksperimentelle behov og vitenskapelige mål i dyrkede celler. Noen eksempler inkluderer eksogene reportergener, overuttrykkskasetter, RNA-interferens og CRISPR-baserte verktøy, inkludert de for genombrede skjermer. rAAV-transduksjoner er mindre skadelige for celler enn elektroporering eller kjemisk transfeksjon og krever ikke noe spesielt utstyr eller dyre reagenser for å produsere. Rålysater eller kondisjonerte medier som inneholder rAAV-er kan tilsettes direkte til dyrkede celler uten ytterligere rensing for å transdusere mange celletyper - en undervurdert egenskap ved rAAV. Her gir vi protokoller for grunnleggende transgen kassettkloning og demonstrerer hvordan man produserer og påfører rå rAAV-preparater på dyrkede celler. Som prinsippbevis demonstrerer vi transduksjon av tre celletyper som ennå ikke er rapportert i rAAV-applikasjoner: placentaceller, myoblaster og små tarmorganoider. Vi diskuterer hensiktsmessige bruksområder for rAAV-preparater, rAAVs begrensninger for genfødsler og hensyn til kapsidvalg. Denne protokollen skisserer en enkel, billig og effektiv metode for forskere å oppnå produktiv DNA-levering i cellekultur ved hjelp av rAAV uten behov for arbeidskrevende titrerings- og rensetrinn.