Экспрессия трансгена в культивируемых клетках с использованием неочищенных рекомбинантных аденоассоциированных вирусных векторов

Рекомбинантные аденоассоциированные вирусные векторы (rAAV) могут достигать мощной и устойчивой экспрессии трансгена без интеграции в широкий спектр типов тканей, что делает их популярным выбором для доставки генов на животных моделях и в клинических условиях. В дополнение к терапевтическому применению, rAAV являются полезным лабораторным инструментом для доставки трансгенов, адаптированных к экспериментальным потребностям исследователя и научным целям, в культивируемые клетки. Некоторые примеры включают экзогенные репортерные гены, кассеты сверхэкспрессии, РНК-интерференцию и инструменты на основе CRISPR, в том числе для полногеномных скринингов. Трансдукция rAAV менее вредна для клеток, чем электропорация или химическая трансфекция, и не требует специального оборудования или дорогостоящих реагентов для производства. Сырые лизаты или кондиционированные среды, содержащие rAAV, могут быть добавлены непосредственно в культивируемые клетки без дополнительной очистки для трансдукции многих типов клеток — недооцененная особенность rAAV. В этой статье мы представим протоколы для базового клонирования трансгенных кассет и продемонстрируем, как производить и применять сырые препараты rAAV к культивируемым клеткам. В качестве доказательства принципа мы продемонстрировали трансдукцию трех типов клеток, о которых еще не сообщалось в приложениях rAAV: клетки плаценты, миобласты и органоиды тонкой кишки. Мы обсуждаем надлежащее использование сырых препаратов rAAV, ограничения rAAV для доставки генов и соображения по выбору капсида. Этот протокол описывает простой, недорогой и эффективный метод, позволяющий исследователям добиться продуктивной доставки ДНК в клеточную культуру с помощью rAAV без необходимости трудоемких этапов титрования и очистки.